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PC Linker BMN (Photocleavable Linker) (Interne Modifikation)
Photocleavable Linker – lichtinduzierte Abspaltung markierter Oligonucleotide
Unter photolabilen Linkerstrukturen versteht man im Allgemeinen eine Verbindung zwischen zwei Molekülen durch einen kurzen Linker, der durch Bestrahlung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge (UV-Licht bei 300-400 nm) spaltbar ist. Die Energiezufuhr in Form von Licht stellt eine einfache, gut regulierbare „Schalterfunktion“ dar, da sie eine gezielte, zeitlich abstimmbare Spaltung der Biomoleküle ermöglicht.
Abbildung 1: Struktur des internen photocleavable Linker BMN (PC Linker BMN) gebunden an ein Oligo.
Bereits die kurze Exposition mit energiereichem Licht durch eine Maldi-Messung reicht aus, um die Spaltprodukte eines Oligos mit internem PC Linker darzustellen.
Abbildung 2 zeigt das Ergebnis der Maldi-Analyse eines dT20-Oligonucleotids mit einem internen photolabilen Linker (PC). Das vollständige Oligonucleotid mit einem Molekulargewicht von 7171 Da zeigt sich in dem großen Peak (grün unterlegt) auf der rechten Seite:
5’-Antraquinon-TTT TTT TTT T-PC-TTT TTT TTT T-BMN Q535-3’ (MW 7171 Da).
Die fast gleich großen Zerfallsprodukte durch den mittig in der Sequenz platzierten PC-Linker sind blau unterlegt: Produkt 1 5’-Phos-TTT TTT TTT T-BMN Q535-3’ (hellblau unterlegt, MW 3536 Da) und Produkt 2 5’-Antraquinon-TTT TTT TTT T-PC modified-3’ (dunkelblau unterlegt, MW 3638 Da).
Die hier dargestellten Spaltprodukte sind durch einen kurzen Laser-Impuls generiert worden, der überwiegende Anteil des Oligos ist ungespalten (grüner Peak). Der linke, große Peak zeigt das doppelt-protonierte Ion des nicht-gespaltenen Konjugats (MW 3587 Da).
a)
b)
Abbildung 3a) zeigt die Spaltreaktion des Oligokonjugats bei Maldi-Laserbeschuss. Die Spaltstelle wird in rot dargestellt. In 3b) werden die entstehenden Spaltprodukte nach dem partiellen Zerfall des PC Linkers dargestellt.
Für eine vollständige Spaltung des photolabilen Linkers im Oligo wird länger exponiert, meist einige Minuten. Bei hinreichend langer Exposition zerfällt auch der Linker selbst. In der folgenden Abbildung 4 zeigt sich nach 30 minütiger Exposition ein weiteres Spaltprodukt, hierbei fällt der bereits gespaltene Linker vollständig von dem Oligo ab.
Abbildung 4) zeigt das Ergebnis der Maldi-Analyse des Oligokonjugats in wässriger Lösung nach Bestrahlung mit UV-Licht bei 365 nm für 30 min. Wird der PC-Linker mit UV-Licht bestrahlt, zerfällt er und fällt vollständig vom Oligo ab. Das Spektrum zeigt die beiden Spaltprodukte des Konjugats:
5’-Antraquinon-TTT TTT TTT T-Phos-3’ (unterlegt in lila, 3459 Da) und 5’-Phos-TTT TTT TTT T-BMN Q535-3’ (unterlegt in hellblau, 3536 Da).
Das Oligokonjugat ist nach UV-Exposition vollständig gespalten.
a)
b)
Abbildung 5a) zeigt die Spaltreaktion des Oligokonjugats bei UV-Bestrahlung. In rot werden die Spaltstellen dargestellt. 5b) stellt die entstehenden Spaltprodukte nach vollständigen Zerfall des PC Linkers dar.
Unter photolabilen Linkerstrukturen versteht man im Allgemeinen eine Verbindung zwischen zwei Molekülen durch einen kurzen Linker, der durch Bestrahlung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge (UV-Licht bei 300-400 nm) spaltbar ist. Die Energiezufuhr in Form von Licht stellt eine einfache, gut regulierbare „Schalterfunktion“ dar, da sie eine gezielte, zeitlich abstimmbare Spaltung der Biomoleküle ermöglicht.
Abbildung 1: Struktur des internen photocleavable Linker BMN (PC Linker BMN) gebunden an ein Oligo.
Bereits die kurze Exposition mit energiereichem Licht durch eine Maldi-Messung reicht aus, um die Spaltprodukte eines Oligos mit internem PC Linker darzustellen.
Abbildung 2 zeigt das Ergebnis der Maldi-Analyse eines dT20-Oligonucleotids mit einem internen photolabilen Linker (PC). Das vollständige Oligonucleotid mit einem Molekulargewicht von 7171 Da zeigt sich in dem großen Peak (grün unterlegt) auf der rechten Seite:
5’-Antraquinon-TTT TTT TTT T-PC-TTT TTT TTT T-BMN Q535-3’ (MW 7171 Da).
Die fast gleich großen Zerfallsprodukte durch den mittig in der Sequenz platzierten PC-Linker sind blau unterlegt: Produkt 1 5’-Phos-TTT TTT TTT T-BMN Q535-3’ (hellblau unterlegt, MW 3536 Da) und Produkt 2 5’-Antraquinon-TTT TTT TTT T-PC modified-3’ (dunkelblau unterlegt, MW 3638 Da).
Die hier dargestellten Spaltprodukte sind durch einen kurzen Laser-Impuls generiert worden, der überwiegende Anteil des Oligos ist ungespalten (grüner Peak). Der linke, große Peak zeigt das doppelt-protonierte Ion des nicht-gespaltenen Konjugats (MW 3587 Da).
a)
b)
Abbildung 3a) zeigt die Spaltreaktion des Oligokonjugats bei Maldi-Laserbeschuss. Die Spaltstelle wird in rot dargestellt. In 3b) werden die entstehenden Spaltprodukte nach dem partiellen Zerfall des PC Linkers dargestellt.
Für eine vollständige Spaltung des photolabilen Linkers im Oligo wird länger exponiert, meist einige Minuten. Bei hinreichend langer Exposition zerfällt auch der Linker selbst. In der folgenden Abbildung 4 zeigt sich nach 30 minütiger Exposition ein weiteres Spaltprodukt, hierbei fällt der bereits gespaltene Linker vollständig von dem Oligo ab.
Abbildung 4) zeigt das Ergebnis der Maldi-Analyse des Oligokonjugats in wässriger Lösung nach Bestrahlung mit UV-Licht bei 365 nm für 30 min. Wird der PC-Linker mit UV-Licht bestrahlt, zerfällt er und fällt vollständig vom Oligo ab. Das Spektrum zeigt die beiden Spaltprodukte des Konjugats:
5’-Antraquinon-TTT TTT TTT T-Phos-3’ (unterlegt in lila, 3459 Da) und 5’-Phos-TTT TTT TTT T-BMN Q535-3’ (unterlegt in hellblau, 3536 Da).
Das Oligokonjugat ist nach UV-Exposition vollständig gespalten.
a)
b)
Abbildung 5a) zeigt die Spaltreaktion des Oligokonjugats bei UV-Bestrahlung. In rot werden die Spaltstellen dargestellt. 5b) stellt die entstehenden Spaltprodukte nach vollständigen Zerfall des PC Linkers dar.
