Peptidnucleinsäuren
 

Peptidnucleinsäuren oder kurz PNAs (peptide nucleic acids) sind gerade in in vivo Systemen extrem stabil und zeigen bemerkenswerte Hybridisierungseigenschaften, sodass sie für eine Vielzahl interessanter Anwendungen eingesetzt werden können.
Im Aufbau ähneln Peptidnucleinsäuren sehr einem DNA-Molekül. Anstelle eines negativ geladenen Zucker-Phosphat-Rückgrats verfügen PNAs aber über ein neutrales Rückgrat aus sich wiederholenden, über Peptidbindung verknüpften N-(2-Aminoethyl)-Glycineinheiten (AEG).¹ Die Nucleobasen A/G/C/T sind über einen Acetamid-Linker mit dem Rückgrat verbunden.⁵ Peptidnucleinsäuren können über Peptidbindungen leicht mit anderen Peptiden oder Fluoreszenzfarbstoffen konjugiert werden, wodurch sie für viele therapeutische und diagnostische Anwendungen interessant sind.¹

Die hohe Sequenzselektivität und Affinität der Peptidnucleinsäuren zu DNA- oder RNA-Molekülen ergeben sich aus den richtigen intramolekularen Abständen im Molekül und der Hybridisierung zwischen komplementären Nucleinsäuren. Hierbei bindet die PNA über Watson-Crick Basenpaarung an das jeweils andere DNA- bzw. RNA-Molekül. Aufgrund des neutralen Rückgrats der PNA gibt es dabei keine elektrostatische Abstoßung durch die negativ geladene DNA bzw. RNA.¹
Aus diesem Grund haben Peptidnucleinsäuren eine höhere Bindungsaffinität als native DNA oder RNA. Verglichen mit DNA/DNA- oder DNA/RNA-Molekülen ist die Schmelztemperatur pro Basenpaar um ca. 1°C höher. Diese höhere Thermostabilität und die damit verbundenen verbesserten Hybridisierungseigenschaften sind hierbei unabhängig von der umgebenden Salzkonzentration. Um die Löslichkeit und Bindungsaffinität für Nucleinsäuretargets weiter zu erhöhen, können zusätzlich positiv geladene Lysinreste in das neutrale Rückgrat eingebaut werden.⁵
Durch die hohe Bindungsaffinität gewährleisten schon kurze Peptidnucleinsäuren (13-18 Basen Länge) eine hohe Spezifität.
Peptidnucleinsäuren binden exzellent an komplementäre mRNA und können dadurch deren Funktion beeinflussen. Durch die stabile Bindung und hohe Spezifität sind sie sogar in der Lage, DNA-Doppelstränge aufzubrechen und PNA/DNA-Triplexe oder auch mit einem intakten DNA-Doppelstrang Doppelduplexe zu bilden.¹

Weitere forschungsrelevante Eigenschaften von Peptidnucleinsäuren sind zum einen die Resistenz gegen enzymatische Degradation (Proteasen, Nucleasen), zum anderen die hohe chemische und thermische  Stabilität. Die erhöhte Resistenz gegenüber dem enzymatischen Abbau durch intrazelluläre Proteasen oder Nucleasen ist auf das dem Enzym fremden Peptidrückgrat zurückzuführen, sodass PNAs auch zellintern über lange Zeiträume stabil sind.5 

Damit können PNAs beispielsweise ideal in den folgenden Anwendungen eingesetzt werden:

• Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung
  - kurze, sehr spezifische und selektive Sonden möglich, hohe Stabilität
   
• Antisense/Antigen Wirkung von PNAs
  - hohe Sequenzspezifität für ein Target in der Gensequenz
  - Bindung an komplementäre mRNA und Beeinflussung ihrer Funktion
  - Inhibierung der Transkription und Translation von Targetgenen
  - Bildung PNA/DNA-Triplex oder Doppelduplex1
  - Verbesserung der zellulären Verfügbarkeit der PNA durch Bindung an Cell Penetrating Proteins (CPP)5
  - Blockierung spezifischer miRNA Aktivität
   
• SNP-Detektion
  - direkte Detektion des SNP Mismatches in DNA-Fragmenten2
   
• PCR Clamping und künstliche Restriktionsenzyme
  - SNP-Assay (PNA-Clamps zur Inhibierung der Polymerase)3,4
   
• Microarrays und Biosensoren
   
• Molecular Beacons
  - Anwesenheit spezifischer Sequenzen durch Fluoreszenznachweis2
   

Literatur:
1. Peptide Nucleic Acid (PNA) and Its Applications. Wonyong Koh:
Peptide Nucleic Acid (PNA) and Its Applications

2. Advantages of Peptide Nucleic Acids as Diagnostic Platforms for Detection of Nucleic Acids in Resource-limited Settings. Zhang N, Appella DH; J Infect Dis. (2010), 201 (Suppl 1): S42-5.
Advantages of Peptide Nucleic Acids

3. Genetic heterogeneity of the epidermal growth factor receptor in non-small cell lung cancer cell lines revealed by a rapid and sensitive detection system, the peptide nucleic acid-locked nucleic acid PCR clamp. Nagai Y, Miyazawa H, Huqun, Tanaka T, Udagawa K, Kato M, Fukuyama S, Yokote A, Kobayashi K, Kanazawa M, Hagiwara K.; Cancer Research (2005), 65:7276-82.

4. Peptide nucleic acid-locked nucleic acid polymerase chain reaction clamp-based detection test for gefitinib-refractory T790M epidermal growth factor receptor mutation. Miyazawa H, Tanaka T, Nagai Y, Matsuoka M, Huqun, Sutani A, Udagawa K, Zhang J, Hirama T, Murayama Y, Koyama N, Ikebuchi K, Nagata M, Kanazawa M, Nukiwa T, Takenoshita S, Kobayashi K, Hagiwara K; Cancer Sci. (2008), 99(3):595-600.

5. A Review of Peptide Nucleic Acid. Siddiquee S, Rovina K, Azriah A; Advanced Techniques in Biology and Medicine (2015), Volume 3, Issue 2.

Die Synthese von Peptidnucleinsäuren erfolgt analog zur Festphasensynthese von Peptiden. Dabei reagiert die Carboxylgruppe eines PNA-Bausteins mit der Aminogruppe eines weiteren Bausteins unter Ausbildung einer Amidbindung:

Wie in der Peptidsynthese kann t-Boc- oder Fmoc-Chemie genutzt werden. Bei der Fmoc-Synthese ist die Aminogruppe des N-(2-Aminoethyl)-Glycin-Bausteins durch die Fmoc-Gruppe und die der Base durch die Bhoc-Gruppe geschützt.

PNA-Synthesebausteine:

Die PNA-Kette wird an der festen Phase, einem sogenannten Harz, aufgebaut. Im ersten Schritt wird der C-terminale Baustein der PNA-Kette mit seiner Carboxylgruppe an einen festen Träger gebunden. Die Synthese erfolgt daher vom C-Terminus zum N-Terminus. Sie besteht aus einer Abfolge von Synthesezyklen, die als Schritte jeweils das Entschützen der Aminogruppe des N-(2-Aminoethyl)-Glycins, die Aktivierung der Carboxylgruppe des zu koppelnden Synthesebausteins, die Kopplung und das Capping von noch freien Aminogruppen enthalten. 

Ist die PNA-Kette vollständig, wird sie vom Harz abgespalten. In diesem Schritt werden auch die Bhoc-Schutzgruppen entfernt. Die PNA wird mittels RP-HPLC gereinigt, wobei kürzere Fragmente abgetrennt werden.¹
 

Literatur:
1. Synthesis of PNA Oligomers by Fmoc-Chemistry. Casale R, Jensen IS, Egholm M; Peptide Nucleic Acids, Protocols and Applications (2004), Horizon Bioscience.

Standardmäßig bieten wir PNAs von 6-25 Basen Länge in den Mengen 30 nmol, 100 nmol und 1 µmol an. Die Reinheit beträgt ca. 80%, wobei eine zusätzliche Aufreinigung auf 90% gegen Aufpreis möglich ist.
Die Identität der PNAs wird durch Maldi-Massenspektrometrie und die Reinheit durch analytische HPLC belegt.

Aufgrund des verwendeten Trägers liegt die PNA als C-terminales Amid vor. 
Es hat sich gezeigt, dass mit zunehmender Länge (ab ca. 5 Basen) homopolymere Sequenzen bzw. Sequenzabschnitte (v.a. Poly-T und Poly-A) zu einer starken Aggregation neigen, die die Löslichkeit in wässrigen Lösungen beeinträchtigen kann. 

biomers.net bietet die Peptidnucleinsäure-Oligomere in Kooperation mit der INTAVIS Peptide Services GmbH an.
Die Synthese von PNA-Oligonucleotiden dauert 4-6 Wochen. Je nach Komplexität der PNA kann die Synthese auch längere Zeit in Anspruch nehmen. 

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