Lagern und Lösen
 

• Am besten werden Oligonucleotide in trockenem Zustand gelagert. Sie sind grundsätzlich recht stabil, sogar bei Aufbewahrung bei Raumtemperatur oder 4°C. Für Lagerzeiten von über 3 Monaten sollten aber auch trockene Oligonucleotide besser bei -20°C gelagert werden.
• Die größte Gefahr für gelöste Oligonucleotide liegt im Abbau durch Nucleasen. Deshalb bei -20°C lagern, wodurch die Nuclease-Aktivität minimiert wird.
• Wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden (Davis et al., 2000). Also auch Stock-Lösungen idealerweise in Aliquots einfrieren oder, noch besser, lyophilisieren.
• Gebrauchsverdünnungen von 10 pmol/µl oder weniger sind häufig instabil, deshalb nur kleine Mengen verdünnen und nach wenigen Auftau-Einfrier-Zyklen neue Verdünnungen herstellen.
• Fluoreszenzmarkierte Oligonucleotide grundsätzlich im Dunkeln lagern.
• Thiol-modifizierte Oligonucleotide neigen zur Oxidation und zeigen im Vergleich zu anderen modifizierten Oligos eine geringere Stabilität.

Ausgehend von der Synthese werden Oligonucleotide immer als einzelsträngige Moleküle synthetisiert. Für manche weiterführenden Anwendungen mit Oligos ist jedoch die Herstellung eines Doppelstrangs erforderlich.

Die Hybridisierung zweier kurzer komplementärer Oligos ist unkompliziert und funktioniert eigentlich "von selbst":

• Oligos auf gleiche molare Konzentrationen lösen
• gleiche Volumina mischen
• 2 min auf 95°C erhitzen
• langsam auf RT abkühlen lassen
   

Um ein optimales Ergebnis zu erhalten, ist es hilfreich, einige Details zu beachten:

1.Material

Für die Ausbildung und Aufrechterhaltung von doppelsträngiger DNA oder RNA in wässriger Lösung sind Salze zwingend erforderlich. Da Oligos meist bereits ausreichend Salz mitbringen (üblicherweise in Form von Na⁺), können kurze, unmodifizierte Oligos in reinem Wasser gelöst und erfolgreich hybridisiert werden.
Die Zugabe weiterer und anderer Salze sowie eine gepufferte Lösung können hilfreich sein. Die Rezepte für Annealing-Puffer variieren hierbei von 10 mM Tris, pH 7,5 bis zu 100 mM Kaliumacetat, 30 mM Hepes-KOH (pH 7,4), 2 mM Magnesiumacetat oder 75 mM KCl, 20 mM Tris .
Da jedoch viele Salze, besonders zweiwertige Ionen, Einfluss in nachfolgenden Methoden z.B. auf DNA-Polymerasen haben, ist die Zugabe von komplexen Salzgemischen für das Annealing sorgfältig abzuwägen.

2.Methode

Für eine erfolgreiche und vollständige Hybridisierung ist es notwendig, gleiche Mengen beider Stränge einzusetzen. Dazu werden die beiden Oligos auf die gleiche molare Konzentration (z.B. 100 pmol/µl) eingestellt, um dann mit gleichen Volumina gemischt zu werden.

Die Hybridisierung der beiden Stränge passiert 'von selbst'. Um interne Sekundärstrukturen aufzuschmelzen und den Molekülen ausreichend "Bewegungsenergie" mitzugeben, wird der Annealing-Ansatz zunächst für ca. 3-5 min auf ca. 95° erhitzt. Bei kurzen Oligos reichen 2 min sicherlich aus.

Um den Oligos ausreichend Zeit zu geben, die komplementäre Sequenz zu finden und vollständig zu hybridisieren, ist es optimal, den Ansatz langsam über mehrere Stunden auf Raumtemperatur abkühlen zu lassen. Ideal ist z.B. ein einfaches Wasserbad (oder auch ein Heizblock), das ausgeschaltet wird und in geschlossenem Zustand langsam auskühlt.
Alternativ kann auch ein PCR-Gerät verwendet werden. Auch hier kann das Gerät nach dem Erhitzen einfach ausgeschaltet werden. 
Bis zur weiteren Verwendung wird der Oligoduplex bei 4°C gelagert.

Zu viel Aufwand?

Gern erhalten Sie bereits annealte Oligos von biomers.net. Verwenden Sie hierfür bitte das Excel-Bestellformular und vermerken Sie im Anmerkungsfeld, welche Oligos miteinander hybridisiert werden sollen.

Das annealte Produkt wird -wenn nicht anders angegeben- trocken geliefert.
Durch Zugabe von sterilem Wasser ist der Duplex einsatzbereit.

Gern stehen wir Ihnen für weitere Details und alle Fragen rund um Oligos jederzeit zur Verfügung:
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