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Lagern und Lösen
 

Lösen von Oligonucleotiden

Lösen von Oligonucleotiden

 

biomers.net empfiehlt, Oligonucleotide in sterilem Wasser bei neutralem Milieu (pH 7,0) zu lösen. Bei dem saurem pH des Wassers, das die meisten Wasseranlagen produzieren, ist ein Puffer vorzuziehen, der den pH-Wert leicht in den basischen Bereich verschiebt. Hierzu eignen sich z.B. Tris-HCl, TE, PBS oder TSE.

Vor dem ersten Öffnen eines lyophilisierten Oligonucleotids das Gefäß kurz zentrifugieren, damit das Pellet nicht am Deckel hängt.

 
  • Modifizierte Oligonucleotide werden ebenfalls am besten in Wasser bei pH 7 oder in den erwähnten Puffern gelöst. Achtung: Cyanin-Farbstoffe sind instabil im alkalischen Milieu! Besonders Cyanine 5-markierte Oligonucleotide sollten bei pH 7,0 gelöst werden!
  • Das Oligo nur lösen, wenn es auch gebraucht wird. Wird es nicht sofort verwendet, lagert es am besten in trockenem Zustand.
  • Wie immer bei Arbeiten mit Nucleinsäuren erhöht sauberes, nucleasefreies Arbeiten die Lebensdauer von DNA und RNA und ist der Behandlung z.B. mit DEPC (siehe unten) vorzuziehen.
  • Die Zugabe von EDTA zu Tris schadet dem Oligonucleotid selbst sicher nicht, sollte aber bei nachfolgenden enzymatischen Reaktionen mitberechnet werden.
  • Die Verwendung von Wasser mit pH-Werten unter 7,0 kann zu Depurinierungen im Oligonucleotid führen. Durch Zugabe von z.B. Natronlauge sollte deshalb der pH des Wassers auf etwas über pH 7,0 aber unter pH 8,5 angehoben oder ein passender Puffer verwendet werden.
  • DEPC-(Diethyl-Pyrocarbonat)-behandelte Lösungsmittel werden auf Grund der hohen Giftigkeit nicht empfohlen, auch nicht bei nachfolgender Kombination mit RNase-sensitiven Methoden. Neben einer geringen Genotoxizität von DEPC, bildet dies zusammen mit Ammonium-Ionen, wie sie beispielsweise bei der Fällung von Nucleinsäuren zum Einsatz kommen, das hochgradig karzinogene Ethylcarbamat. Darüber hinaus modifiziert DEPC Purine in Einzelsträngen; so veränderte RNA wird schlecht revers transkribiert (Ehrenberg et al, 1976; Mandiyan et al, 1990).
 
 

Lagern von Oligonucleotiden

Lagern von Oligonucleotiden

  • Am besten werden Oligonucleotide in trockenem Zustand gelagert. Sie sind grundsätzlich recht stabil, sogar bei Aufbewahrung bei Raumtemperatur oder 4°C. Für Lagerzeiten von über 3 Monaten sollten aber auch trockene Oligonucleotide besser bei -20°C gelagert werden.
  • Die größte Gefahr für gelöste Oligonucleotide liegt im Abbau durch Nucleasen. Deshalb bei -20°C lagern, wodurch die Nuclease-Aktivität minimiert wird.
  • Wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden (Davis et al., 2000). Also auch Stock-Lösungen idealerweise in Aliquots einfrieren oder, noch besser, lyophilisieren.
  • Gebrauchsverdünnungen von 10 pmol/µl oder weniger sind häufig instabil, deshalb nur kleine Mengen verdünnen und nach wenigen Auftau-Einfrier-Zyklen neue Verdünnungen herstellen.
  • Fluoreszenz-markierte Oligonucleotide grundsätzlich im Dunkeln lagern.
  • Thiol-modifizierte Oligonucleotide neigen zur Oxidation und zeigen im Vergleich zu anderen modifizierten Oligos eine geringere Stabilität.
     
 

Annealing von Oligonucleotiden

Annealing von Oligonucleotiden

 

Ausgehend von der Synthese werden Oligonucleotide immer als einzelsträngige Moleküle synthetisiert. Für manche weiterführenden Anwendungen mit Oligos ist jedoch die Herstellung eines Doppelstrangs erforderlich.

Die Hybridisierung zweier kurzer komplementärer Oligos ist unkompliziert und funktioniert eigentlich "von selbst":

  • Oligos auf gleiche molare Konzentrationen lösen
  • gleiche Volumina mischen
  • 2 min auf 95°C erhitzen
  • langsam auf RT abkühlen lassen
     

Um ein optimales Ergebnis zu erhalten, ist es hilfreich, einige Details zu beachten:

1.Material

Für die Ausbildung und Aufrechterhaltung von doppelsträngiger DNA oder RNA in wässriger Lösung sind Salze zwingend erforderlich. Da Oligos meist bereits ausreichend Salz mitbringen (üblicherweise in Form von Na+), können kurze, unmodifizierte Oligos in reinem Wasser gelöst und erfolgreich hybridisiert werden.
Die Zugabe weiterer und anderer Salze sowie eine gepufferte Lösung können hilfreich sein. Die Rezepte für Annealing-Puffer variieren hierbei von 10 mM Tris, pH 7,5 bis zu 100 mM Kaliumacetat, 30 mM Hepes-KOH (pH 7,4), 2 mM Magnesiumacetat oder 75 mM KCl, 20 mM Tris .
Da jedoch viele Salze, besonders zweiwertige Ionen, Einfluss in nachfolgenden Methoden z.B. auf DNA-Polymerasen haben, ist die Zugabe von komplexen Salzgemischen für das Annealing sorgfältig abzuwägen.

2.Methode

Für eine erfolgreiche und vollständige Hybridisierung ist es notwendig, gleiche Mengen beider Stränge einzusetzen. Dazu werden die beiden Oligos auf die gleiche molare Konzentration (z.B. 100 pmol/µl) eingestellt, um dann mit gleichen Volumina gemischt zu werden.

Beispiel:
Konzentration der Einzelstränge: 100 pmol/µl, je 50 µl werden annealt - Sie erhalten 100 µl Lösung mit 50 pmol/µl Doppelstrang.

      Oligo            Menge  [µl]               Konzentration [pmol/µl]
Oligo 1 50 µl 100 pmol/µl 
Oligo 2 50 µl 100 pmol/µl
Duplex 100 µl 50 pmol/µl


Die Hybridisierung der beiden Stränge passiert 'von selbst'. Um interne Sekundärstrukturen aufzuschmelzen und den Molekülen ausreichend "Bewegungsenergie" mitzugeben, wird der Annealing-Ansatz zunächst für ca. 3-5 min auf ca. 95° erhitzt. Bei kurzen Oligos reichen 2 min sicherlich aus.

Um den Oligos ausreichend Zeit zu geben, die komplementäre Sequenz zu finden und vollständig zu hybridisieren, ist es optimal, den Ansatz langsam über mehrere Stunden auf Raumtemperatur abkühlen zu lassen. Ideal ist z.B. ein einfaches Wasserbad (oder auch ein Heizblock), das ausgeschaltet wird und in geschlossenem Zustand langsam auskühlt.
Alternativ kann auch ein PCR-Gerät verwendet werden. Auch hier kann das Gerät nach dem Erhitzen einfach ausgeschaltet werden. 

Bis zur weiteren Verwendung wird der Oligoduplex bei 4°C gelagert.


Zu viel Aufwand?

Gern erhalten Sie bereits annealte Oligos von biomers.net. Verwenden Sie hierfür bitte das Excel-Bestellformular und vermerken Sie im Anmerkungsfeld, welche Oligos miteinander hybridisiert werden sollen.

Das annealte Produkt wird -wenn nicht anders angegeben- trocken geliefert.
Durch Zugabe von sterilem Wasser ist der Duplex einsatzbereit.

Gern stehen wir Ihnen für weitere Details und alle Fragen rund um Oligos jederzeit zur Verfügung:
Tel +49 731 70 396 0   I   info@biomers.net