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Real-Time PCR Probes
 

Unter Real-time PCR versteht man eine PCR, die durch die Verwendung geeigneter Hilfsmittel in ihrem Fortgang beobachtet werden kann. Im Gegensatz zu einer herkömmlichen PCR, bei der das Endergebnis im allgemeinen auf einem Agarose-Gel analysiert wird, kann bei der Real-time PCR in jedem einzelnen Zyklus die Zunahme der DNA-Menge -eben in Echtzeit- beobachtet werden. Damit ist eine Quantifizierung möglich, die in Diagnostik und Validierung zu ganz neuen Möglichkeiten geführt hat. Die direkte Beobachtung wird durch die Verwendung fluoreszierender Farbstoffe erreicht. Diese können, wie SybrGreen® und ähnliche Produkte, einfach an doppelsträngige DNA anlagern und so die Generierung neuer Doppelstränge in jedem Zyklus anzeigen.

Eleganter und meist sensitiver, aber auch aufwändiger und nicht für jede Fragestellung geeignet ist die Verwendung von sogenannten Sonden oder 'probes', die zusätzlich zu den Primern in die Reaktion gegeben werden und an das Amplikon binden. Die Bindung der Sonden auf dem amplifizierten Bereich gewährleistet zum einen eine höhere Spezifität, zum anderen kann die Bindung selbst durch die Verwendung geeigneter Hilfsmittel direkt sichtbar gemacht werden. Hierzu werden üblicherweise Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt, deren emittiertes Licht direkt nachgewiesen werden kann.


                                   

Abbildung 1: Vergleich der Amplifikationskurven (normalisiert) eines qPCR-Assays mit 5´-6-Fam-markierten Sonden und vier verschiedenen 3´-Quenchern.
In jedem Ansatz wurden die gleichen Primer und die gleiche Sondensequenz eingesetzt. Die Assays wurden in zweifacher Ausführung durchgeführt
(Genaxxon ProbeMasterMix No ROX, MyGo Pro, vorkalibrierter Fam-Kanal).
Im direkten Vergleich zeigen die Quencher (BMN-Q535, BMN-Q620, BHQ-1 und TQ2) nahezu identische Ergebnisse mit dem Fluoreszenzfarbstoff 6-Fam. 


Mit Hilfe von Quenchern ( von quench=löschen, dämpfen, ersticken) kann die Fluoreszenz gezielt "angeschaltet" werden, sobald die Sonde spezifisch gebunden hat. Grundsätzlich können neben vielen Varianten fünf Grundtypen unterschieden werden, die im folgenden in ihren wesentlichen Punkten kurz dargestellt sind.

DL-Probes - BMN-Quencher

Dual-Labelled Probes mit BMN-Q460, BMN-Q535, BMN-Q590, BMN-Q620 und BMN-Q650

 

Im Vergleich dazu wird bei dem sogenannten TaqMan®-Assay eine Sonde so auf der Ziel-DNA plaziert, dass diese "im Weg" der Polymerase sitzt.

Im hybridisierten Zustand der Sonde reicht die räumliche Nähe von Fluorophor und Quencher, um die Fluoreszenz  zu quenchen (abzuschalten). Während der PCR wird nun die
3´-5´-Exonuklease-Aktivität der Taq-Polymerase genutzt, um die Sonde abzubauen. Dadurch werden Fluorophore und Quencher voneinander getrennt und die Fluoreszenz freigesetzt.

Gerne stehen wir Ihnen beim Design von diesen Sonden und den zugehörigen Primern zur Seite.

 

Dual-Labelled Probes mit BMN-Quenchern

5'-Fluorophor ABS [nm] EM [nm] empfohlener
BMN-Quencher
          Preisgruppe
Atto 425 436 484 BMN-Q460 3
Atto 465 453 508 BMN-Q460 3
Fam 494 520 BMN-Q535 1
Joe 520 548 BMN-Q535 3
Hex 535 556 BMN-Q535 1
Cyanine 3 550 570 BMN-Q590, BMN-Q620 2
Atto 550 554 579 BMN-Q590, BMN-Q620 4
Atto Rho 11 572 595 BMN-Q590, BMN-Q620 4
Rox 574 602 BMN-Q590, BMN-Q620 2
Cyanine 3.5 588 604 BMN-Q590, BMN-Q620 2
Atto Rho 101 586 610 BMN-Q590, BMN-Q620 4
Atto 647N 646 664 BMN-Q650, BMN-Q620 4
Cyanine 5 649 670 BMN-Q650, BMN-Q620 2
Cyanine 5.5 675 694 BMN-Q650, BMN-Q620 2

 

Preisgruppe Preis in Scale S (EUR)1 Preis in Scale M (EUR)1 Preis in Scale L (EUR)1
1 59,00 € 225,00 € 360,00 €
2 74,90 € 225,00 € 360,00 €
3 95,00 € 225,00 € 360,00 €
4 169,00 € 240,00 € 400,00 €

 
1 Im Preis inbegriffen ist jeweils ein Oligonucleotid bis max. 30 Basen inklusive HPLC-Reinigung und der Maldi-Qualitätskontrolle mit den oben genannten Fluorophor/Quencher-Kombinationen. Der Aktionspreis ist nur gültig für elektronische Bestellung über das biomers.net Online-Bestellformular zzgl. ges. MwSt. und ggf. Versandkosten. Weitere Konditionen ergeben sich aus der jeweils gültigen Preisliste. Preisänderungen und Irrtum vorbehalten. Der genannte Aktionspreis ist nicht mit anderen Rabatten (außer Frühaufsteher-Rabatt) kombinierbar.

DL-Probes - BHQ, TQ, BBQ, Tamra

Dual-Labelled Probes mit den Quenchern BHQ, TQ, BBQ und Tamra

5'-Fluorophor ABS [nm] EM [nm] 3'-Quencher             Preisgruppe
Atto 425 436 484 BHQ-1
BBQ-650
4
4
Fam 494 520 TQ2
BHQ-1
BBQ-650
Tamra
1
2
2
2
Joe 520 548 TQ2
BHQ-1
3
3
Hex 535 556 TQ2
BHQ-1
BBQ-650
1
2
2
Cyanine 3 550 570 TQ3
BBQ-650
BHQ-2
1
2
2
Atto 550 554 579 BHQ-2
BBQ-650
4
4
Atto Rho 11 572 595 BHQ-2 4
Rox 574 602 TQ3
BBQ-650
BHQ-2
1
2
2
Cyanine 3.5 588 604 TQ3
BBQ-650
BHQ-2
1
2
2
Atto Rho 101 586 610 BHQ-2 4
Atto 647N 646 664 BHQ-2
BBQ-650
4
4
Cyanine 5 649 670 BBQ-650
BHQ-2
2
2
Cyanine 5.5 675 694 BBQ-650 2

 

Preisgruppe Preis in Scale S (EUR)1 Preis in Scale M (EUR)1 Preis in Scale L (EUR)1
1 74,90 € 240,00 € 400,00 €
2 95,00 € 240,00 € 400,00 €
3 125,00 € 240,00 € 400,00 €
4 195,00 € 240,00 € 400,00 €


1 Im Preis inbegriffen ist jeweils ein Oligonucleotid bis max. 30 Basen im Scale S (garantierte Liefermenge >1OD) inklusive HPLC-Reinigung und der Maldi-Qualitätskontrolle mit den oben genannten Fluorophor/Quencher-Kombinationen. Der Aktionspreis ist nur gültig für elektronische Bestellung über das biomers.net Online-Bestellformular zzgl. ges. MwSt. und ggf. Versandkosten. Weitere Konditionen ergeben sich aus der jeweils gültigen Preisliste. Preisänderungen und Irrtum vorbehalten. Der genannte Aktionspreis ist nicht mit anderen Rabatten (außer Frühaufsteher-Rabatt) kombinierbar.

5'-Yakima Yellow / 3'-BHQ-1, BBQ-650


Yakima Yellow® ist als Reporterfarbstoff in qPCR-Sonden eine sehr gute und viel verwendete Alternative zum Farbstoff VIC von Applied Biosystems. Einige weitere Farbstoffe mit ähnlichen Emissionsmaxima haben wir zum Vergleich ebenfalls aufgelistet:

Farbstoff ABS [nm] EM [nm]
Joe 520 548
Rhodamin 6G 524 552
Yakima Yellow® 526 548
Atto 532 532 554
Sima 535 556
Hex 535 556
VIC 538 554
DY-530 539 561
 

Bei Bestellung von drei oder mehr qPCR-Probes pro Auftrag mit 5'-Yakima Yellow und 3'-BHQ-1 bzw. BBQ-650 im Synthesescale S berechnen wir nur 149,00 EUR2 pro Sonde dieses Typs (statt 195,00 EUR).

2 Im Preis inbegriffen ist jeweils ein Oligonucleotid bis max. 40 Basen im Scale S (garantierte Liefermenge >1 OD) inklusive HPLC-Reinigung und Maldi-Qualitätskontrolle mit den oben genannten Fluorophor/Quencher-Kombinationen. Der Aktionspreis ist nur gültig für elektronische Bestellungen über das biomers.net Online-Bestellformular zzgl. ges. MwSt. und ggf. Versandkosten. Weitere Konditionen ergeben sich aus der jeweils gültigen Preisliste. Preisänderungen und Irrtum vorbehalten. Der genannte Aktionspreis ist nicht mit anderen Rabatten (außer Frühaufsteher-Rabatt) kombinierbar
Yakima Yellow ist eine registrierte Marke von Epoch Biosciences, Inc. Vic ist ein Warenzeichen von Applied Biosystems, Foster City, U.S.A.

DQ-Probes

Höhere Sensitivität für Ihre qPCR mit DoubleQuenched Probes von biomers.net


Die üblichen qPCR Sonden für 5'-Nuclease Assays tragen am 5'-Ende einen Fluorophor und am 3'-Ende einen passenden Quencher, welcher zum einen die Fluoreszenz des Farbstoffes löscht und zum anderen die Verlängerung der Sonde während der qPCR-Reaktion verhindert. Bei längeren Sonden und damit größerem Abstand zwischen Fluorophor und Quencher nimmt der Background oft in ungewünschtem Maße zu.

Mit DoubleQuenched Probes verringert sich der Background und erhöht sich die Sensitivität. Durch Einbau eines zusätzlichen Quenchers (z.B. BMN-Q460BMN-Q535 oder BMN-Q620) in die Sequenz nahe des 5'-Fluorophors kann eine deutliche Verbesserung der Resultate erzielt werden.

DoubleQuenched Probes enthalten einen 5'-Fluorophor, einen 3'-BMN-Quencher und einen internen BMN-Quencher in einem Abstand von 8-10 Basen vom Fluorophor. 

Dual-Labelled Probe DoubleQuenched Probe

 

Dual-labelled Probe mit dem Fluorophor Fam und dem Quencher BMN-Q530

DoubleQuenches Probe mit dem Fluorophor Fam und dem Quencher BMN-Q530 (intern und terminal)
5'-Fam, 3'-BMN-Q535 5'-Fam, int. BMN-Q535, 3'-BMN-Q535


Standard Dual-Labelled Probes und DoubleQuenched Probes mit BMN-Quenchern können über das biomers.net Web-Bestellformular online bestellt werden; für DoubleQuenched Probes siehe Bestellanleitung. 

Für weitere Informationen und Unterstützung bei der Bestellung kontaktieren Sie bitte gerne unseren Kundenservice.

Eine ausführliche Bestellanleitung finden Sie hier.

Molecular Beacons

Molecular Beacons

Eine weitere Variante stellen die Molecular Beacons® dar. Wie bei den daraus abgeleiteten Scorpions®-Oligos, weisen Molecular Beacons eine ´stem´ -Region (stem=Stamm) auf. Diese setzt sich aus einer kurzen Region zueinander komplementärer Nucleinsäuren zusammen, sodass sich das Molekül mit sich selbst falten kann. Die spezifische Sondensequenz, die komplementär zur Targetsequenz ist, bildet in dieser Konformation die sogenannte Loop-Region. 

 

In Abwesenheit eines passenden Targets werden die jeweils terminal gekoppelten Modifikationen (Farbstoff und Quencher) durch den ´stem´ in enger räumlicher Nähe gehalten, sodass die Fluoreszenz inhibiert wird. In diesem Zustand überträgt der Fluorophor seine Elektronen auf den Quencher, der diese Energie wiederum in Form von längerwelligen Licht oder Wärme abgibt.

In Anwesenheit eines passenden Targetmoleküls öffnet sich der Beacon durch Bindung der ´loop´-Region an die entsprechende Zielsequenz. Dieses Sonden-Target-Hybridmolekül ist länger und so konzipiert, dass die Bindung an die Targetregion thermodynamisch begünstigt ist und deshalb letztendlich zur Öffnung des Molecular Beacons führt. Die Änderung der Konformation trennt hierbei Fluorophor und Quencher, sodass die Fluoreszenz freigesetzt werden kann. 

Molecular Beacons sind äußerst spezifisch und sind im Idealfall in der Lage Unterschiede zu identifizieren, die lediglich auf einem einzelnen Nucleotid beruhen. Die Länge der Sondensequenz wird dafür so gewählt, dass sie ein perfekt komplementäres Sonden-Target-Hybridmolekül bilden können, das gerade stabiler ist als die komplementäre ´stem´-Region. Bereits ein abweichendes Nucleotid in der Sondensequenz verringert dann die Stabilität des Sonden-Target-Moleküls ausreichend, sodass die Stabilität der ´stem´-Region überwiegt und die Öffnung des Molecular Beacon verhindert wird. 

Aufgrund ihres besonderen Verhaltens sind Molecular Beacons vielseitig einsetzbar:

  • PCR
  • Detektion bestimmter RNAs in lebenden Zellen1
  • Amplicon-Detektion in der Diagnostik
  • Multiplex Assays zur Detektion verschiedener Targets in einem Reaktionsansatz
  • SNP Detektion 
  • Pharmakogenetische Anwendungen 
  • Genetisches Screening (Genotypbestimmung eines Locus)


Unter www.molecular-beacons.org erhalten Sie umfassende Informationen über Molecular Beacons und ihre Einsatzgebiete.

Wir freuen uns, Ihnen den Service unseres Probe Designs für Molecular Beacons®, Scorpions® und TaqMan® Probes anbieten zu können. 
Schicken Sie uns hierzu einfach die Basensequenz Ihres Targets, das Sie testen möchten. Unsere erfahrenen Spezialisten designen Ihre individuelle Probe. 

Wenn Sie weitere Informationen zu diesem Thema wünschen, kontaktieren Sie uns bitte jederzeit. 
Tel +49 731 70 396 0   ǀ   info@biomers.net

Synthese-Scale    S M L
Garantierte Menge**   > 1 OD > 3 OD > 6 OD
5‘-Fluorophor 3‘-Quencher      
6-Fam, Hex, Tet Dabcyl, DDQ-l, BHQ-1, 
TQ-2, BBQ-650
* * *
Yakima Yellow BHQ-1, TQ-2, BBQ-650
 
* * *
Cyanine 3, Cyanine 5, Tamra, 
Rox, TexasRed
BHQ-2, TQ-3, BBQ-650,
DDQ-ll
* * *
Atto dye, DY dye BHQ, TQ, BBQ-650
 
* * *


*Preise entnehmen Sie bitte der aktuellen Preisliste. Weitere Kombinationen auf Anfrage. ** Die Mengenwerte gelten für gemischte Sequenzen und können für Sequenzen mit starken Sekundärstrukturen und Homopolymere abweichen. Die niedrigen Mengenwerte sind für ein 20mer DNA-Oligonucleotid garantiert.



Literatur:
1. Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells. Sokol DL, Zhang X, Lu P, Gewirtz AM; Proc Natl Acad Sci USA (1998),11538-43.

Scorpions

Scorpions

Scorpions-Primer sind mehrfach modifizierte Spezialanfertigungen, die bei einer besonderen Variante der Real-time PCR für hochspezifische Signale eingesetzt werden.

Scorpions-Oligos tragen am 5´-Ende eine Fluorophore, die bei unhybridisierten Sonden durch eine entsprechend designte 'stem'-Struktur' in enger räumlicher Nähe zu einem Quencher gehalten wird. In 3'-Richtung folgt dem Quencher ein Primer-Bereich, der in der PCR-Reaktion zusammen mit dem unmodifizierten Gegenprimer zur Amplifikation der gewünschten Ziel-DNA führt. Um das Auffüllen der Scorpions-Sonde zum Doppelstrang bei der PCR zu verhindern, wird eine weitere Modifikation verwendet, die die Polymerase daran hindert, den 5´-gelegenen Bereich des Scorpions-Oligos zu erreichen. 

In der PCR-Reaktion ist der Ablauf der folgende:

Zunächst lagert sich der Primer-Bereich an die entsprechende Zielsequenz an, nach der Elongation des Scorpions-Primers kann sich die 'stem'-Struktur öffnen und mit dem neu synthetisierten Strang hybridisieren. 
Dadurch wird die Fluorophore aus dem Einflussbereich des Quenchers entfernt, so dass die Fluoreszenz nun zur Detektion genutzt werden kann.

biomers.net bietet Scorpions mit folgenden Konditionen an:

Synthese-Scale     S M L
Garantierte Menge**     > 1 OD > 2 OD > 4 OD
5‘-Fluorophor Quencher Blocker * * *
6-Fam, Hex, Tet int. BHQ-1, int. Dabcyl Spacer18 * * *
Cyanine 3, Cyanine 5 int. BHQ-2, int. Dabcyl Spacer18 * * *
Atto dye, DY dye int. BHQ Spacer18 * * *


*Preise entnehmen Sie bitte der aktuellen Preisliste. Weitere Kombinationen auf Anfrage. ** Die Mengenwerte gelten für gemischte Sequenzen und können für Sequenzen mit starken Sekundärstrukturen und Homopolymere abweichen. Die niedrigen Mengenwerte sind für ein 20mer DNA Oligonucleotid garantiert.
Scorpions Primer werden mit Lizenz von DxS hergestellt.
Preise sind inklusive DNA-Oligonucleotid bis 60 Basen, 5´-Fluorophore, interner Kopplung des Quenchers sowie des Polymerase-Blockers, HPLC-Reinigung und Maldi-Qualitätskontrolle und gelten nur für elektronische Bestellungen.

Fret Probes

Fret Probes

Eine verwandte Anwendung findet sich im LightCycler®-Assay. Dazu werden zwei Sonden hintereinander auf der Ziel-DNA plaziert. Durch die Bindung beider Sonden wird eine extrem hohe Spezifität der Real-time PCR erreicht, die zum Beispiel eng verwandete Gene oder Organismen differenzieren kann. 

Die 5´-gelegene Sonde trägt an ihrem 3´-Ende eine Fluorophore, deren Fluoreszenz nicht direkt gemessen, sondern zur Anregung der Fluorophore der zweiten Sonde genutzt wird. Durch diese Übertragung (FRET: fluorecsence resonance energy transfer) wird bei erfolgreicher Bindung beider Sonden die Fluoreszenz der 3´-gelegenen Sonde detektiert.