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In situ Hybridisierung
 

Fluorescent Probes

Fluoreszenz-Sonden 

 

Oligonucleotide für Fluorescence in situ Hybridisierung (FISH) Fluoreszenzfarbstoff-Oligonucleotid-Konjugate. Alle fluoreszenzmarkierten Oligonucleotide werden durch speziell ausgearbeitete HPLC-Verfahren gereinigt, Farbstoffüberschüsse, sowie teil- und/oder unmodifizierte Oligobestandteile werden dabei vollständig abgetrennt. Qualitätskontrolle mit Maldi-Massenspektrometrie garantiert die Identität der Oligonucleotidsonden. Je nach Fragestellung stehen unterschiedliche Markierungsgrade zur Verfügung:

monoProbes
 

Die Klassiker. Sonden mit einem Fluoreszenzfarbstoff am 5'-Ende des Oligonucleotids.

Fam, Cyanine 3, Cyanine 5, Atto-dyes, Dyomics-Dyes      
Synthese-Scale S M L
Garantierte Menge > 2 OD > 5 OD > 15 OD

 

dopeProbes
 

Durch zweifache Fluoreszenzmarkierungen der Oligonucleotidsonden kann in in situ Hybridisierungsexperimenten (DOPE-FISH) eine annähernde Verdopplung der Signalintensitäten erreicht werden. Die biomers.net dopeProbes werden am 5´- und 3´-Ende mit identischen Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelt.



Literatur:
1. Double Labeling of Oligonucleotide Probes for Fluorescence in Situ Hybridization (DOPE-FISH) Improves Signal Intensity and Increases rRNA Accessibility. Stoecker K, Dorninger C, Daims H, Wagner M; Appl. Environ. Microbiol. (2010), 76, 922-926.

3',5'-Fam, Cyanine 3, Cyanine 5, Tamra                           
Synthese-Scale S M L
Garantierte Menge > 1 OD > 3 OD > 6 OD

 

tetraProbes
 

Höchste Sensitivität durch 4-fach-Markierung. Die Fluoreszenzfarbstoffe werden verteilt über die Oligolänge im Rückgrat angeordnet; die Hybridisierungseigenschaften werden dadurch kaum beeinflusst und "Self-Quenching-Effekte" werden vermieden. In hybridisiertem Zustand verhält sich die Signalintensität nahezu linear zur Anzahl der Farbstoffe pro Oligo, d.h. unter ansonsten identischen Bedingungen leuchten tetraProbes etwa doppelt so hell wie dopeProbes und viermal so hell wie monoProbes.

z.B. Fam, Atto 488 usw.                                                      
Synthese-Scale S M L
Garantierte Menge > 1 OD > 3 OD > 6 OD

 

hrp Probes

HRP-markierte Oligonucleotide


Oligonucleotide, konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase (HRP = horseradish peroxidase), einem etwa 40 kDa schweren Enzym, gewinnen als Sonden für Fluoreszenz in situ-Hybridisierungen (FISH) zum Nachweis von Mikroorganismen zunehmend an Bedeutung. Durch Kombination von HRP-Probes und Tyramid Signalamplifikations-Systemen (TSA) können, im Vergleich zu Fluorescein-einfach-markierten Sonden, vielfach höhere Signalintensitäten erzielt werden. Diese Methode wird als "Catalyzed Reporter Deposition - Fluorescent in situ Hybridisation" (CARD-FISH) bezeichnet und wird zum quantitativen Nachweis von Mikroorganismen eingesetzt.
biomers.net verfügt über eine langjährige Erfahrung in der Synthese und Aufreinigung von qualitativ hochwertigen HRP-Oligonucleotid-Konjugaten. 


Herstellungsverfahren:

Ein Oligonucleotid, üblicherweise etwa 18-25 Nucleotide lang, wird am 5’-Ende mit einem Aminolink modifiziert. Diese reaktive Aminogruppe wird mit einem bifunktionalen Crosslinker gekoppelt und aktiviert. Die zweite reaktive Seite des Crosslinkers wird in einem weiteren Schritt mit einer freien Aminogruppe der Peroxidase zur Reaktion gebracht. Es resultiert ein Konjugat, verknüpft über chemisch stabile kovalente Bindungen. Durch geeignete Wahl der Reaktionsbedingungen und Reagenzienüberschüsse wird in etwa eine 1:1 Kopplung zwischen Oligonucleotid und Peroxidase erreicht.

Zur Reinigung und Isolierung des Konjugates hat sich die Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) als am besten geeignetes Verfahren erwiesen.


biomers.net bietet HRP Oligonucleotide standardmäßig in drei Synthesemaßstäben an:

Synthese-Scale S M L
Ausbeute an Konjugat > 1 OD > 2 OD > 4 OD


Andere Mengen und Scales sind auf Anfrage erhältlich. Im Komplettpreis eingeschlossen ist jeweils das Oligonucleotid bis 30 Basen, die Konjugation an HRP und die PAGE-Reinigung. Bei einer größeren Anzahl von HRP-Oligos pro Bestellung unterbreiten wir Ihnen gerne ein Angebot.

smFISH - OligoPool 48

Oligonucleotide für single molecule in situ hybridisation (smFISH)


Bei Genexpressionsanalysen in intakten Zellen im Gewebe nimmt die in situ RNA-Detektion einen immer größeren Stellenwert ein. Oft erweist sich jedoch der Nachweis kurzer, häufig nur in wenigen Kopien vorliegende mRNA in der Zelle als sehr schwierig und aufwendig1. Um die Anzahl, sowie den Wirkort einer bestimmten RNA in der Zelle besser darstellen zu können, werden daher äußerst sensitive Methoden benötigt. 

Bei der sogenannten single molecule fluorescence in situ hybridisation (smFISH) werden einzelne RNA-Moleküle in fixierten Zellen mithilfe von 24 bzw. 48 kurzen, einzeln 3´-markierten Oligonucleotidsonden nachgewiesen. 
Durch die Bindung der komplementären Oligosonden an verschiedene Bereiche des Targets wird die nachzuweisende mRNA als kleiner fluoreszierender Punkt im Mikroskop sichtbar2

Da smFISH Probes auch in der Lage sind an partiell degradierte RNA zu binden, ist diese Methode auch bestens für fixierte Zellen oder eingebettetes Gewebe geeignet. Die große Anzahl an Sonden im Set gewährleistet zudem ein hohes Maß an Sensitivität und Spezifität, sodass die Wahrscheinlichkeit falsch-positiver Ergebnisse minimiert werden kann3. Erfolgt im Einzelfall eine unspezifische Bindung „off-target“, so kann lediglich eine schwache Fluoreszenz detektiert werden, die jedoch unterhalb der Detektionsgrenze spezifisch-bindender mRNA liegt.
Der Einsatz verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe mit deutlich voneinander abgrenzbaren Emissionsspektren ermöglicht des Weiteren die Detektion mehrerer verschiedener mRNA-Moleküle in einer Zelle. Diese sogenannten Multiplex-Imaging Assays helfen z.B. bei der Erstellung von Einzelzell-Genexpressionsprofilen. 

Zur Detektion bestimmter RNA in einer Zelle bietet biomers.net Ihnen ein komplettes Set von 24 bzw. 48 einfach-markierten Oligosonden an. Jeder dieser kundenspezifischen Oligo Pools wird mittels HPLC gereinigt und mit Maldi Massenspektrometrie qualitätskontrolliert. 

Modifikation           ABS [nm]             EM [nm]                 Preiskategorie
Fam 494 520 1
Atto 488 501 523 2
Cyanine 3 550 570 1
Atto 550 554 579 2
Atto 565 563 592 2
Cyanine 3.5 588 604 1
Atto 594 601 627 2
Atto 647N 646 664 2
Cyanine 5 649 670 1
HRP     3

 

                    Preiskategorie*                OligoPool 24                 OligoPool 48
1 395,00 EUR 459,00 EUR
2 495,00 EUR 595,00 EUR
3 1290,00 EUR 1890,00 EUR


Unser Excel-Bestellformular für Angebotsanfragen oder Bestellungen finden Sie hier.

Für weitere Informationen kontaktieren Sie bitte jederzeit gerne unser Kunden Support Team. Wir beraten Sie gerne bei der Auswahl der für Sie passenden Produkte.
Tel 0731 70 396 0   I   info@biomers.net

* Im Preis inbegriffen ist jeweils ein Oligonucleotid-Pool mit 24 oder 48 Oligosonden mit jeweils 18-25 Basen im Scale S (garantierte Liefermenge > 1 OD, 5 nmol gepooltes Oligo) inklusive HPLC-Reinigung und Maldi-Qualitätskontrolle. Die Preise sind nur gültig für elektronisch einlesbare Bestellungen zuzüglich Mehrwertsteuer und gegebenenfalls Versandkosten. Auf Wunsch bieten wir Ihnen auch Oligonucleotid-Pools mit 36 oder 96 Oligosonden an. Weitere Konditionen ergeben sich aus der jeweils gültigen Preisliste. Preisänderungen und Irrtum vorbehalten.



Literature:

1. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Ray A, van den Bogaard P, Rifkin SA, van Oudenaarden A, Tyagi S; Nature Methods (2008), Vol.5 No.10, 877-879.

2. Single Molecule Imaging of RNA in Situ. Batish M, Raj A, Tyagi S; Methods in Molecular Biology (2011), vol.714, DOI 10.1007/978-1-61779-005-8_1.

3. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules. Kwon S; BMB Reports – Manuscript Draft, BMB-13-016 (2013), 65-72.

Links

Links für Probe Design 

 

Für das Design und die Anwendung von Probes im Bereich der in-situ Hybridisierung empfehlen wir Ihnen die folgenden Links:
 

Arb-Silva (www.arb-silva.de)
Die SILVA rRNA Datenbank ist ein Projekt des Max-Planck-Instituts für Marine Mikrobiologie in Bremen. Die SILVA Datenbank ist die weltweit größte und aktuellste Sammlung ribosomaler RNA-Sequenzen aller Lebensformen (Bakterien, Archaeen und Eukaryoten) und damit für taxonomische und phylogenetische Fragestellungen eine der ersten Adressen. Neben speziell entwickelter Software für das Aligning, Handling und die Auswertung der Sequenzdaten bietet die Webseite eine umfassende Arbeits- und Troubleshooting-Sammlung für Fluoreszenz in situ-Hybridisierungen.

Ribocon (www.ribocon.com)
Ribocon bietet Industrie und Akademien aus dem Bereich der Umwelt-, klinischen und molekularen Mikrobiologie bioinformatische Dienstleistungen und Lösungsvorschläge an. Insbesondere bei mikrobiellen Diversitätsanalysen, phylogenetischen Untersuchungen und beim Design kundenspezifischer Probes verfügt das Ribocon Team über exzellente und jahrelange Erfahrungen.

probeBase (www.microbial-ecology.net/probebase
Der Onlineserver probeBase wird von der Abteilung der mikrobiellen Ökologie der Universität Wien zur Verfügung gestellt. Er ermöglicht die gezielte Suche von FISH-und Microarray-Sonden und PCR-Primern nach Name, Sequenz oder Zielorganismus. Darüber hinaus ist eine ausführliche Dokumentation der gelisteten Probes verfügbar.

Protocols (www.environmental-microbiology.de/lab_issues.html)
Eine Sammlung informativer Laborprotokolle und hilfreicher Links stellt Ihnen die Abteilung der Mikrobiologie der Technischen Universität München zur Verfügung.