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Reaktive Linker
 

Aminolink

Aminolink


Ein Aminolink fügt eine endständige Aminogruppe (NH2) an einem Linker an. Die Aminogruppe bietet die Möglichkeit, über eine Amidbindung verschiedene weitere Moleküle zu koppeln, beispielsweise Farbstoffe oder auch Proteine wie HRP. Auch bei DNA-Arrays kommt der Aminolink zum Einsatz und wird hier genutzt, um die Oligonucleotide auf vorbereiteten Oberflächen anzuheften. Für verschiedene Anwendungen stehen unterschiedlich lange Linker zur Verfügung.

Ein Aminolink kann sowohl am 5´- als auch am 3´-Ende gekoppelt werden. Modifikationen am 3´-Terminus von Oligonucleotiden machen diese in der Regel resistenter gegen Exonuclease-Abbau. Darüber hinaus kann eine Aminogruppe auch direkt innerhalb des Oligonucleotids angeknüpft werden. Hierzu eignet sich besonders gut die Methyl-Gruppe am C5 von Thymidin-Nucleotiden. Statt dieser wird eine Aminogruppe über einen C6-Linker eingefügt. Dadurch wird gewährleistet, dass die Aminogruppe möglichst wenig mit der DNA wechselwirkt und ein so modifiziertes Oligonucleotid vergleichbar hybridisiert wie das entsprechende unmodifizierte.


Die Abbildungen zeigen das entschützte Endprodukt, wie es am fertigen Oligonucleotid zum Einsatz kommen kann.


     Amino Linker unterschiedlicher Länge am 3´- oder 5´-Terminus eines Oligonucleotids
 

Thiol / Maleimid

Thiol und Maleimid


Endständige reaktive SH-Gruppen, z.B. zur Kopplung mit Maleimiden, können durch Thiolinker in Oligos eingeführt werden. Üblicherweise werden dabei C3- oder C6-Linker verwendet. Thiole und Maleimide reagieren leicht miteinander und ergeben eine stabile kovalente Verknüpfung beider Moleküle. Hierfür kann das Oligo entweder mit Thiol oder Maleimid aktiviert werden, je nachdem in welcher Form die Modifikation zur Verfügung steht. Beide Varianten sind möglich. 
Ein interner Thiol-C6-SS-Linker erzeugt eine unter reduktiven Bedingungen spaltbare Stelle innerhalb einer Oligokette.
Zur Bindung von Oligonucleotiden an Goldoberflächen eignet sich neben einfachen Thiolen auch eine Thioctsäure-Modifikation; aufgrund der zwei Schwefelatome ist die Bindung zum Gold stärker.

OPSS, das Orthopyridyl Disulfid, ist eine endständige Modifikation, die mit einer SH-Gruppe eine stabile Disulfidbrücke ausbilden kann. Hierbei können an ein OPSS-modifiziertes Oligonucleotid Proteine, Peptide oder andere Biomoleküle, wie auch Oberflächen gekoppelt werden. Ebenso ist es möglich, die OPSS-Modifikation an die gewünschten Strukturen zu binden und das entsprechende Oligonucleotid mit einer Thiol-Verbindung zu modifizieren. 


   Thiol and Maleimide
 

Click-Chemie

Click-Chemie


Der Begriff „Click-Chemie“ beschreibt üblicherweise eine stark thermodynamisch begünstigte, schnelle Reaktion, die eine effiziente und selektive Verknüpfung zweier Moleküle ermöglicht. Im engeren Sinne versteht man unter „Click-Reaktion“ heutzutage eine Cycloadditionsreaktion zwischen einem Azid und einem Alkin. Es wird unterschieden zwischen der kupfer-katalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition und der kupferfreien Click Chemie. Die Click-Reaktion verläuft sehr effizient in wässrigem Medium und ist daher für die Anknüpfung von Modifikationen an Biomoleküle oder die Verknüpfung von unterschiedlichen Biomolekülen geeignet. Sie ist weitgehend unempfindlich gegenüber anderen funktionellen Gruppen (z.B. Amino, Carboxy) und eröffnet daher viele Möglichkeiten.

Eine große Auswahl unserer Alkin- und Azidlinker, sowie der kupferfreien Varianten (DBCO, TCO, Tetrazin) finden Sie unter Click-Chemie.

 

Carboxylinker 

Carboxylinker 


 

Carboxylinker 
 

Aldehyde

Aldehyde


Aldehyde sind äußerst reaktive Verbindungen, die für die Verknüpfung von Oligonucleotiden mit anderen Biomolekülen genutzt werden können. Ganz allgemein reagieren hierbei Carbonylverbindungen (Aldehyde) mit Nukleophilen (Aminogruppen, Thiolverbindungen, etc.). Bei den Aminogruppen kann es sich um einfache Aminolinker (primäre und sekundäre Amine), aber auch um Hydrazin oder Aminooxyverbindungen handeln.  
Aufgrund der teilweise komplex ablaufenden Reaktionen, werden Aldehyd-Reaktionen mit Aminooxyverbindungen (z.B. Aminooxyessigsäure) bevorzugt. Die Aminooxyessigsäure (AOA) reagiert mit Aldehyden zu stabilen Oximen.



Abbildung 1: Reaktionsschemata eines Aldehyd-tragenden Oligonucleotids mit einem AOA-markierten Protein. 

         
 


Literatur:

1. Organic Chemistry, 4th edition. Carey FA; Chapter 22, p.858.

Cyanobenzothiazol / Cystein

CBT und Cystein – selektive Verknüpfung zweier Biomoleküle 

 

Die Konjugationsreaktion zwischen Cyanobenzothiazol (CBT) und Aminothiolen, wie z.B. Cystein stellt einen weiteren effektiven Mechanismus dar, Biomoleküle kovalent miteinander zu verbinden. Das Konjugat dieser beiden Moleküle ergibt Luciferin, das Licht-generierende Substrat des Enzyms Luciferase, diese Reaktion ist seit langem als letzter Schritt der Luciferin-Synthese bekannt. 1 
Die Reaktion von Aminothiolen und Cyanobenzothiazol läuft unter physiologischen Bedingungen spontan innerhalb lebender Zellen ab. 2

 



Abbildung 1: Reaktionsschema eines Cyanobenzothiazol-tragenden Oligonucleotids mit einem geeigneten Protein, das ein N-terminales Cystein trägt. 

Cyanobenzothiazol reagiert dabei ausschließlich mit N-terminalen Cysteinen am Protein, nicht jedoch mit Cysteinen innerhalb der Aminosäuresequenz (Ausnahme siehe Ramil et al. 3). Da natürlich vorkommende Proteine für gewöhnlich kein terminales Cystein aufweisen, erlaubt dies ein effizientes und spezifisches Markieren entsprechend konstruierter Proteine. 

Wir bieten Cyanobenzothiazol als 5´-Markierung am Oligonucleotid bis zu einer Länge von 45 Basen an. 


Abbildung 2: Cyanobenzothiazol C5 am 5´-Ende eines Oligonucleotids. 

Neben der Kopplung an Proteine (Abbildung 3a), findet die CBT-Cystein-Reaktion auch im Bau von
Nanostrukturen oder bei der Immobilisierung 4 Anwendung. Deshalb kann neben CBT-modifizierten Oligonucleotiden auch Cystein an das 5'-Ende von Oligos angehängt werden (Abbildung 3b, exemplarische Konjugation zweier Oligonucleotide).

a)                                                                                     b)

        

Abbildung 3a) zeigt die Maldi-Analyse einer Konjugationsreaktion zwischen einem Oligo und einem Peptid. Der blaue Peak stellt ein Cyanobenzothiazol-markiertes Oligo mit einer zusätzlichen Fluoreszenzmarkierung am 3´-Ende dar: EUB338-Sonde CBT-gctgcctcccgtaggagt-6-Fam (MW 6497). Dieses Oligo wurde mit einem Poly-Histidin (His6) mit N-terminalem Cystein konjugiert (MW 935). Der grüne Peak zeigt mit der Summe der beiden Molekulargewichte das Ergebnis der Konjugation.
Abbildung 3b): Die Reaktion der beiden Cystein- und CBT-markierten Oligos (in hellblau: Cystein-gctgcctcccgtaggagt, MW 5849, in dunkelblau: EUB338 CBT-gctgcctcccgtaggagt-6-Fam, MW 6497) ergibt das Konjugat mit einem summierten Molekualrgewicht von 12261 (grüner Peak).


Zum Schutz der freien reaktiven Thiolgruppe liefern wir Cystein-markierte Oligos in geschützter Form (Cystein mit StBu Schutzgruppe). Vor weiteren Konjugationsschritten muss dem Kunjugationspuffer ein geeignetes Reduktionsmittel (z.B. TCEP) zugesetzt werden, um das Disulfid des Cysteins zu reduzieren und die Thiolgruppe freizusetzen. 

          

Abbildung 4: Cystein mit einer StBu Schutzgruppe wird durch Behandlung mit TCEP zu freiem, reaktiven Cystein. 



Literatur:

1. The structure and synthesis of firefly luciferin. White EH, McCapra F, Field GF, McElroy WD; J. Am. Chem. Soc. (1961), 83:2402–2403.

2. A biocompatible condensation reaction for controlled assembly of nanostructures in live cells. Liang G, Ren H, Rao J; Nat Chem. (2010), 2(1): 54–60. 

3. Sequence-Specific 2-Cyanobenzothiazole Ligation. Ramil CP, An P, Yu Z, Lin Q; J Am Chem Soc. (2016), 15(6):829-35. 

4. Site-specific immobilization of biomolecules by a biocompatible reaction between terminal cysteine and 2-cyanobenzothiazole. Wang P, Zhang CJ, Chen G, Na Z, Yao SQ, Sun H; Chem Commun (Camb). (2013); 49(77):8644-6.