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Reaktive Linker
 

Aminolink

Aminolink


Ein Aminolink fügt eine endständige Aminogruppe (NH2) an einem Linker an. Die Aminogruppe bietet die Möglichkeit, über eine Amidbindung verschiedene weitere Moleküle zu koppeln, beispielsweise Farbstoffe oder auch Proteine wie HRP. Auch bei DNA-Arrays kommt der Aminolink zum Einsatz und wird hier genutzt, um die Oligonucleotide auf vorbereiteten Oberflächen anzuheften. Für verschiedene Anwendungen stehen unterschiedlich lange Linker zur Verfügung.

Ein Aminolink kann sowohl am 5´- als auch am 3´-Ende gekoppelt werden. Modifikationen am 3´-Terminus von Oligonucleotiden machen diese in der Regel resistenter gegen Exonuclease-Abbau. Darüber hinaus kann eine Aminogruppe auch direkt innerhalb des Oligonucleotids angeknüpft werden. Hierzu eignet sich besonders gut die Methyl-Gruppe am C5 von Thymidin-Nucleotiden. Statt dieser wird eine Aminogruppe über einen C6-Linker eingefügt. Dadurch wird gewährleistet, dass die Aminogruppe möglichst wenig mit der DNA wechselwirkt und ein so modifiziertes Oligonucleotid vergleichbar hybridisiert wie das entsprechende unmodifizierte.


Die Abbildungen zeigen das entschützte Endprodukt, wie es am fertigen Oligonucleotid zum Einsatz kommen kann.


     Amino Linker unterschiedlicher Länge am 3´- oder 5´-Terminus eines Oligonucleotids
 

Thiol / Maleimid

Thiol und Maleimid


Endständige reaktive SH-Gruppen, z.B. zur Kopplung mit Maleimiden, können durch Thiolinker in Oligos eingeführt werden. Üblicherweise werden dabei C3- oder C6-Linker verwendet. Thiole und Maleimide reagieren leicht miteinander und ergeben eine stabile kovalente Verknüpfung beider Moleküle. Hierfür kann das Oligo entweder mit Thiol oder Maleimid aktiviert werden, je nachdem in welcher Form die Modifikation zur Verfügung steht. Beide Varianten sind möglich. 
Ein interner Thiol-C6-SS-Linker erzeugt eine unter reduktiven Bedingungen spaltbare Stelle innerhalb einer Oligokette.
Zur Bindung von Oligonucleotiden an Goldoberflächen eignet sich neben einfachen Thiolen auch eine Thioctsäure-Modifikation; aufgrund der zwei Schwefelatome ist die Bindung zum Gold stärker.

OPSS, das Orthopyridyl Disulfid, ist eine endständige Modifikation, die mit einer SH-Gruppe eine stabile Disulfidbrücke ausbilden kann. Hierbei können an ein OPSS-modifiziertes Oligonucleotid Proteine, Peptide oder andere Biomoleküle, wie auch Oberflächen gekoppelt werden. Ebenso ist es möglich, die OPSS-Modifikation an die gewünschten Strukturen zu binden und das entsprechende Oligonucleotid mit einer Thiol-Verbindung zu modifizieren. 


   Thiol and Maleimide
 

Click-Chemie

Click-Chemie


Der Begriff „Click-Chemie“ beschreibt üblicherweise eine stark thermodynamisch begünstigte, schnelle Reaktion, die eine effiziente und selektive Verknüpfung zweier Moleküle ermöglicht. Im engeren Sinne versteht man unter „Click-Reaktion“ heutzutage eine Cycloadditionsreaktion zwischen einem Azid und einem Alkin. Es wird unterschieden zwischen der kupfer-katalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition und der kupferfreien Click Chemie. Die Click-Reaktion verläuft sehr effizient in wässrigem Medium und ist daher für die Anknüpfung von Modifikationen an Biomoleküle oder die Verknüpfung von unterschiedlichen Biomolekülen geeignet. Sie ist weitgehend unempfindlich gegenüber anderen funktionellen Gruppen (z.B. Amino, Carboxy) und eröffnet daher viele Möglichkeiten.

Eine große Auswahl unserer Alkin- und Azidlinker, sowie der kupferfreien Varianten (DBCO, TCO, Tetrazin) finden Sie unter Click-Chemie.

 

Carboxylinker 

Carboxylinker 


 

Carboxylinker 
 

Aldehyde

Aldehyde


Aldehyde sind äußerst reaktive Verbindungen, die für die Verknüpfung von Oligonucleotiden mit anderen Biomolekülen genutzt werden können. Ganz allgemein reagieren hierbei Carbonylverbindungen (Aldehyde) mit Nukleophilen (Aminogruppen, Thiolverbindungen, etc.). Bei den Aminogruppen kann es sich um einfache Aminolinker (primäre und sekundäre Amine), aber auch um Hydrazin oder Aminooxyverbindungen handeln.  
Aufgrund der teilweise komplex ablaufenden Reaktionen, werden Aldehyd-Reaktionen mit Aminooxyverbindungen (z.B. Aminooxyessigsäure) bevorzugt. Die Aminooxyessigsäure (AOA) reagiert mit Aldehyden zu stabilen Oximen.



Abbildung 1: Reaktionsschemata eines Aldehyd-tragenden Oligonucleotids mit einem AOA-markierten Protein. 

         
 


Literatur:

1. Organic Chemistry, 4th edition. Carey FA; Chapter 22, p.858.

Cyanobenzothiazol / Cystein

CBT und Cystein – effektive Proteinmarkierung mittels modifizierter Oligonucleotide

 

Mithilfe Cyanobenzothiazol-markierter Oligonucleotide können geeignete Peptide, Proteine oder andere Moleküle schnell und selektiv markiert und für die Detektion in der Zelle vorbereitet werden, ohne dabei deren Funktion einzuschränken oder zu inhibieren. Hierbei ist die Reaktivität und Spezifität des Cyanobenzothiazol-Oligo-Tags vor allem von der Sequenz des Proteins abhängig. Um ein stabiles Addukt und eine schnelle und effiziente Reaktion des Cyanobenzothiazol-tragenden Oligos mit einem Molekül zu gewährleisten, ist ein endständiges Cystein am Molekül zwingend notwendig. 

Hierfür kann das Oligo entweder mit CBT oder Cystein markiert werden, je nachdem in welcher Form die Modifikation zur Verfügung steht. Beide Varianten sind hierbei möglich.
 



Abbildung 1: Reaktionsschemata eines Cyanobenzothiazol-tragenden Oligonucleotids mit einem geeigneten Protein, das ein N-terminales Cystein trägt. 

Die gängige Kopplung von Proteinen und Oligos über Click-Chemie kann aufgrund toxischer Kupferionen intrazellulär nicht angewendet werden. Cyanobenzothiazol ermöglicht hingegen die Kopplung eines Proteins mit einem Oligonucleotid auch in vivo. 
Auf diese Weise wird eine spezifische Markierung eines Proteins zur Detektion oder Analyse der Proteinstruktur und Funktion gewährleistet. 

Mögliche Anwendungen:
- Markierung und Lokalisierung spezifischer Proteine
- Lumineszenzanalysen in vivo 
- Nachweis und Quantifizierung intrazellulärer, biochemischer Prozesse in Echtzeit 

Das endständige Cystein kann mit Thioestern (native Ligation), sowie Aldehyden reaktive Verbindungen eingehen. 3

 


Wir bieten Ihnen Cyanobenzothiazol und Cystein jeweils als 5´-Markierung am Oligonucleotid an. 

Bitte beachten Sie hierbei, dass das Cystein (tbuSS) in geschützter Form geliefert wird und vor weiteren Konjugationsschritten mit TCEP behandelt werden muss, um das Disulfid zu reduzieren und die Thiolgruppe freizusetzen. Hierbei kann das TCEP beispielsweise dem Konjugationspuffer beigemischt werden. 



Literatur:

1. A Biocompatible In Vivo Ligation Reaction and its Application for Non-Invasive Bioluminescent Imaging of Protease Activity in Living Mice. Godinat A, Park HM, Miller SC, Cheng K, Hanahan D, Sanman LE, Bogyo M, Yu A, Nikitin GF, Stahl A, Dubikovskaya EA; ACS Chem Biol. (2013), 8(5): doi:10.1021/cb3007314.

2. Sequence-Specific 2-Cyanobenzothiazole Ligation. Ramil CP, An P, Yu Z, Lin Q; J Am Chem Soc. (2016), 138(17):5499-502. doi: 10.1021/jacs.6b00982.

3. New phosphoramidite reagents for the synthesis of oligonucleotides containing a cysteine residue useful in peptide conjugation. Stetsenko DA, Gait MJ; Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids (2000); 19(10-12):1751-64.