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Sequenzmodifikationen


Modifikationen bei Oligonucleotiden können sehr vielseitig sein. Hierbei sind neben terminalen Modifikationen, die das
3´- bzw. 5´-Ende eines Oligonucleotids betreffen, auch interne Änderungen in der Sequenz möglich. Der Einbau bestimmter Nucleoside in die Basensequenz kann sich teilweise auch stark auf das Verhalten der Zellen im Organismus auswirken. 
Im Folgenden stellen wir Ihnen einige, der bei uns erhältlichen Sequenzmodifikationen von Oligonucleotiden vor. 

Wobbles

Wobbles


In der Molekulargenetik erklärt die Wobble-Hypothese, wie eine bestimmte tRNA mehr als ein Basentriplett der mRNA (Codon) erkennen kann. Die ersten zwei Positionen des Basentripletts im Codon der mRNA binden üblicherweise die hierzu komplementären Basen des Anticodons der tRNA. Lediglich die erste Position der tRNA ist nicht immer eindeutig festgelegt und lässt z.B. durch Verwendung des seltenen Nucleosids Inosin auch ungewöhnliche Basenpaarungen zu (Wobble-Position). 

Mögliche Varianten die sich daraus ergeben sind: 

Guanosin : Uridin Inosin : Uridin Inosin : Adenosin Inosin : Cytidin
Wobble Basenpaarung
 

Oligonucleotide mit Wobbles (Mischbasen, degenerierte Basen) finden vielfältige Anwendung. Bereits während der Synthese von Oligonucleotiden können an definierten Stellen Wobbles eingebaut werden. Je nach Art der Mischbase führt das zu bestimmten statistischen Basen-Verteilungen an der jeweiligen Position im Oligo.  

Synthese von Wobble-haltigen Oligos:
Viele moderne DNA/RNA-Synthesizer "verstehen" den Einbuchstaben-Code für Wobbles (siehe unten) und mischen die jeweiligen Bausteine während der Synthese automatisch im richtigen Verhältnis (2er-Wobble: 50% der jeweiligen Komponente, 3er-Wobble: jeweils 33% und N=4er-Wobble: jeweils 25%). 
Dieses schnelle und einfache Verfahren führt in aller Regel zu guten Ergebnissen mit geringen Abweichungen von den gewünschten statistischen Verteilungen. Abhängig von der jeweiligen Sequenz und des Reaktivitätsunterschieds der Synthesebausteine können die Abweichungen in Einzelfällen auch größer sein. 
Vor der Synthese der Oligos kann manuelles Mischen der Basen im richtigen Verhältnis die Ergebnisse in kritischen Fällen oder größeren Syntheseansätzen unter Umständen deutlich verbessern. Des Weiteren sind dadurch auch Mischungen möglich, die von einer Gleichverteilung abweichen.
Kontaktieren Sie hierzu gerne unser Customer Support Team.

Reinigung von Oligos mit Wobbles:
Je nach Art und Anzahl der Wobbles setzt sich das hergestellte Oligonucleotid aus einer Vielzahl von unterschiedlichen Sequenzen zusammen. Diese, unter Umständen mehrere Tausend Sequenzen können sich z.B. in ihrem Laufverhalten in Polyacrylamidgelen (PAGE) oder auf der HPLC-Säule unterscheiden. Bei hochgewobbelten Oligos führt das dann zu einer Verbreiterung der entsprechenden Gelbande bzw. Peaks in der HPLC. Insbesondere beim Ausschneiden von Gelbanden besteht die Gefahr, dass einzelne Sequenzen der Wobble-Mischung „verloren gehen“. Wir empfehlen daher keine PAGE-Aufreinigung von Oligonucleotiden mit Mischbasen, bzw. nur nach Absprache mit unserem Technischen Support Team. 

Der nachfolgende, international gültige „Einbuchstaben-Code“ gibt die möglichen Wobble-Kombinationen aus den vier Standardbasen wieder. Bitte verwenden Sie bei der Bestellung von Oligos mit degenerierten Basen diesen Code.
 

Symbol   Erklärung  Basen
  Normale Basen        
A Adenin A      
C Cytosin   C    
G Guanin     G  
T Thymin       T
U Uracil (nur RNA)       U
  Wobble Basen        
W Weak (binding bases) A     T
S Strong (binding bases)   C G  
M aMino A C    
K Keto     G T
R puRine A   G  
Y pYrimidine   C   T
B Not A (B comes after A)   C G T
D Not C (D comes after C) A   G T
H Not G (H comes after G) A C   T
V Not T (V comes after T and U) A C G  
N aNy base A C G T
 

Desoxyinosin (dI)

Desoxyinosin (dI)

 

Neben den vier Basen der DNA, Adenin, Cytosin, Guanin und Thymin, findet man in der RNA noch die Basen Uracil und Inosin, sowie weitere seltene Nucleotide.
Inosin ist ein äußerst seltenes Nucleosid der RNA und setzt sich aus dem Zucker
β-D-Ribofuranose und der Base Hypoxanthin zusammen.

Obwohl Inosin ein Purin ist, kann es sowohl mit Pyrimidinen als auch mit den Purinen der DNA Paarungen eingehen, sodass Inosin auch als „universelle“ oder auch „neutrale“ Base bekannt ist. Manche Paarungen scheinen jedoch energetisch günstiger zu sein als andere, sodass die Bindungen zwischen den einzelnen Basen unterschiedlich stark ausgeprägt sind.

Die Bindungsstärke nimmt hierbei über die folgende Reihe ab:1,2
I:C > I:A > I:G ≥ I:T

Die Affinität von Inosin zu den vier anderen Basen wird des Weiteren stark von der umgebenden Sequenz beeinflusst. Trotz der strukturellen Analogie zu Guanosin, ist die Bindung mit einem Inosin in der gleichen Sequenzumgebung in der Regel jedoch schwächer als mit Guanosin. Paarungen der Basen I:A und I:G führen zudem zu einer veränderten DNA-Topologie, da die beiden einander gegenüber liegenden Purine mehr Platz benötigen.

Biologische Relevanz hat Inosin vor allem in tRNAs. Hier wird die erste Base des Anticodons (=dritte Position des Codons der mRNA) oft mit Inosin besetzt, sodass diese Position flexibler belegt werden kann. Diese sogenannten „Wobble“-Basen („wackelnd“, „kippelnd“) erlauben begrenzt Fehlpaarungen in der dritten Position des Codons.








Desoxyinosin dI
Die folgende Tabelle zeigt die möglichen Fehlpaarungen der Basen an:
tRNA A C G U I
mRNA U G C A A
      U G C
          U
          G
 

Dieser Wobble-Effekt ist auch in Oligonucleotiden möglich. Durch den Einbau eines Inosin-Nucleotids in die Sequenz eines Primers erhält man Primer mit „variablen“ Basen. Diese degenerierten Primer ermöglichen z.B. das Annealing und die Amplifikation mehrerer verwandter Sequenzen. 
Bei der PCR mit degenerierten Primern ist allerdings zu beachten, dass proof-reading-Polymerasen, wie beispielsweise Pfu, dazu neigen, von der DNA abzufallen, wenn sie auf Primer mit Wobble-Basen treffen.3

Hinweise zur Bestellung:
Bitte wählen Sie bei der Bestellung desoxy- oder ribo-Inosin (2´-dInosin, rI) als interne Modifikation aus. Dazu kennzeichnen Sie die Position der internen Modifikationen in Ihrer Sequenz durch die Zahl (5,6,7,8), mit der das entsprechende Pulldown-Menü im Online-Bestellformular gekennzeichnet ist. Falls Sie keinerlei Modifikationen zur Auswahl angezeigt bekommen, sollten Sie sicherstellen, dass Sie bei Ribobasen weder den Scale "XS" noch die Reinigungsart "Kartusche" ausgewählt haben, da beide nicht mit Modifikationen kombiniert werden können.
 



Literatur: 
1. Studies on the base pairing properties of deoxyinosine by solid phase hybridisation to oligonucleotides. Case-Green SC, Southern EM; Nucleic Acids Res. (1994), 22(2):131-6.

2. Base pairing involving deoxyinosine: implications for probe design. Martin FH, Castro MM, Aboul-ela F, Tinoco I Jr.;  Nucleic Acids Res. (1985), 13: 8927-8938.

3. PCR with degenerate primers containing deoxyinosine fails with Pfu DNA Polymerase. Knittel T, Picard D, PCR Methods and Applications (1993), 2: 346-347.

2´-desoxy-Uridin (dU)

Desoxyuridin (dU)

 

Das Nukleosid Desoxyuridin (dU) besteht aus dem Zucker β-D-Desoxyribose und der Nukleinbase Uracil.
Strukturell ähnelt Desoxyuridin sehr dem Desoxythymidin (dT). Lediglich durch die fehlende 5´-Methylgruppe im dU können die beiden Nucleoside unterschieden werden. Die Methylgruppe im dT hat einen leicht stabilisierenden Effekt auf die doppelsträngige Form der DNA. 

Gelegentlich entsteht in lebenden Zellen durch hydrolytische Desaminierung von Cytidin Desoxyuridin. Um eine Falschpaarung während der Replikation der DNA zu verhindern, wird ein Reparaturprogramm in der Zelle eingeleitet. Mithilfe der Uracil-DNA-Glykosylase werden Uracile spezifisch aus der DNA entfernt und abasische Stellen entstehen, die wiederum von Endonukleasen erkannt werden können. Auf diese Weise können gezielt Strangbrüche in der DNA erzeugt werden.

Der Einbau von dUTP in einen Primer kann bewirken, dass dieser aus dem Reaktionsmix gezielt entfernt werden kann. Diese Methode findet z.B. bei der Direkt-Sequenzierung von PCR-Produkten Anwendung, bei der ein Primer nach erfolgreicher PCR-Reaktion direkt für die Sequenzierung des PCR-Produktes eingesetzt werden kann.

Hinweise zur Bestellung:
Bitte beachten Sie auch hier, dass Sie sowohl unsere Desoxybasen, als auch Ribobasen und weitere Modifikationen (5-hm-dU, 5-Br-U, 5-Br-dU, 2´-F-dU,
2´-OMe-U, usw.) während der Online-Bestellung als interne Modifikation eingeben. Die gewünschte Position der internen Modifikation kennzeichnen Sie bitte in der Sequenz durch die Zahl (5-8), mit der das entsprechende Pulldown-Menü im Bestellformular gekennzeichnet ist. Durch Auswahl der gewünschten Modifikation aus dem Pulldown-Menü wird das Zahlensymbol definiert (5-8).










2´-Desoxyuridin dU