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Click Chemie


Der Begriff „Click-Chemie“ beschreibt üblicherweise eine thermodynamisch stark begünstigte, schnelle Reaktion, die eine effiziente und selektive Verknüpfung zweier Moleküle ermöglicht. Im engeren Sinne versteht man unter „Click-Reaktion“ heutzutage eine Cycloadditionsreaktion zwischen einem Azid und einem Alkin. Es wird unterschieden zwischen der kupferkatalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition und der kupferfreien Click-Chemie. Die Click-Reaktion verläuft sehr effizient in wässrigem Medium und ist daher für die Anknüpfung von Modifikationen an Biomoleküle oder die Verknüpfung von unterschiedlichen Biomolekülen geeignet. Sie ist weitgehend unempfindlich gegenüber anderen funktionellen Gruppen (z.B. Amino, Carboxy) und eröffnet daher viele Möglichkeiten.

Kupferkatalysierte Click-Reaktion

Kupferkatalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition

 

Die kupferkatalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC, engl.: copper-catalysed azide-alkyne cycloaddition)1,2 ist eine Weiterentwicklung der von Huisgen beschriebenen klassischen Azid-Alkin-Cycloaddition3. In beiden Fällen entsteht aus einem terminalen Alkin und einem Azid ein 1,2,3-Triazol. Die kupferkatalysierte Version (CuAAC) hat dabei den Vorteil, dass sie regioselektiv ist und bei Raumtemperatur um ein Vielfaches schneller abläuft als die ursprüngliche Huisgen-Reaktion, welche hohe Temperaturen erfordert und dabei noch regioselektiv ist. So wird bei der CuAAC nur das 1,4-Regioisomer des Triazols gebildet.


Kupfer-katalysierte Click Chemie


biomers.net bietet  die folgenden „clickfähigen“  Modifikationen an:

Zur Kopplung eines reaktionsfähigen Alkins an das 5‘-Ende eines Oligos wird ein Phosphoramidit mit einem Cyclohexyl-Zwischenlinker (1) verwendet, als 3‘-Modifikation kommt ein Alkin-Prolinol-Linker (2) zum Einsatz.
​Für interne Alkin-Modifikationen stehen die modifizierten Pyrimidine C8-Alkyne-dU (4) und C8-Alkyne-dC (3) von baseclick (www.baseclick.eu), die eine Alkingruppe über einen Linker an der heterozyklischen Base bereitstellen, sowie die vier 2‘-O-Propargyl-RNA-Bausteine (5), welche eine Alkin-Funktion in der 2‘-Position des Zuckers tragen, zur Verfügung.
Das Azid wird sowohl  endständig wie auch intern über Kopplung von Azidobuttersäure an einen Aminolink bzw. Amino-dT eingeführt (6,7,8,9).
 

Modifikation  5' 3' intern
Alkin (2) (1) (3),(4),(5)
Azid (6), (7), (8) (10) (9)
         

   Azid Alkin Modifikationen



Sämtliche Alkin- und Azid-modifizierten Oligonucleotide werden mit HPLC gereinigt und mithilfe der Maldi-Massenspektrometrie kontrolliert.


 

Literatur:
1. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-Triazoles by regiospecific Copper(I)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. Tornøe CW, Christensen C, Meldal MJ; Org. Chem. (2002), 67, 3057-3064.

2. A stepwise Huisgen cycloaddition process: Copper(I)-catalyzed regioselective ligation of azides and terminal alkynes. Rostovtsev VV, Green LG, Fokin VV, Sharpless KB; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (2002), 41, 2596-2599.

3. 1,3-Dipolar cycloadditions. Huisgen R; Proc. Chem. Soc. (1961), 357-396.
 

Kupferfreie Click-Reaktion

Kupferfreie Click-Reaktion

 

Aufgrund der Toxizität des Kupferkatalysators für Bakterien und Säugetierzellen wurden Reaktionen unter physiologischen Bedingungen entwickelt, die ebenso zielgerichtet und schnell ablaufen wie die CuAAC, jedoch auf die Anwesenheit von Metall-Ionen verzichten können. Ein kurzer Review-Artikel von Schubert et al.1 gibt eine gute Übersicht hierüber.
Vielfache Anwendung findet hierbei die sogenannte "Strain-Promoted Azide-Alkyne Cycloaddition (SPAAC)" 2 von Aziden mit verschiedentlich substituierten Cyclooctinen. Aufgrund der ungünstigen Ringspannung im Cyclooctinring wird die Reaktion stark erleichtert und kann somit spontan und ohne Metallkatalysator ablaufen3.


kupferfreie Click Chemie



DBCO (Dibenzocyclooctyne) bzw. ADIBO (Azadibenzocyclooctyne):

Für kupferfreie Click-Reaktionen existieren diverse Cyclooctin-Derivate, die sich zum Teil deutlich in ihren Reaktionskinetiken und hydrophilen Eigenschaften unterscheiden4,5.  DBCO (Dibenzocyclooctyne), auch unter den Namen ADIBO (Azadibenzocyclooctyne) oder DIBAC (Dibenzoazacyclooctyne) bekannt, findet als "Click-Reaktand" zunehmend Anwendung. Das Cyclooctin DBCO reagiert dabei schnell und selektiv in vielen Reaktionsumgebungen (in vitro und in vivo) mit Aziden zu den entsprechenden Triazolverbindungen.
Als orthogonale Strategie zu herkömmlichen Verknüpfungsreaktionen eignet sich die kupferfreie DBCO-Azid Click-Chemie hervorragend und erlaubt so selektive Mehrfachmarkierungen von Biomolekülen. Zur kupferfreien Click-Chemie bietet biomers.net Oligonucleotide mit DBCO (Dibenzocyclooctyne) als 5'-und 3´-Modifikation an:


DBCO (Dibenzocyclooctyne) bzw. ADIBO (Azadibenzocyclooctyne)


 

Literatur:
1. Click chemistry beyond metal-catalyzed cycloaddition. Becer CR, Hoogenboom R, Schubert US; Angew. Chem. Int. Ed. (2009), 48, 2-11.

2. Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology. Jewett JC, Bertozzi CR; Chem. Soc. Rev. (2010), 39(4):1272.

3. A Strain-promoted [3 + 2] Azide−alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems. Agard NJ, Prescher JA, Bertozzi CR; J. Am. Chem.Soc. (2004), 126, 15046-15047.

4. Aza-dibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3+2) cycloaddition. Debets MF, van Berkel SS, Schoffelen S, Rutjes FP, van Hest JC, van Delft FL; Chem. Commun. (2010), 46: 97.

5. Surface Functionalization Using Catalyst-Free Azide-Alkyne Cycloaddition. Kuzmin A, Poloukhtine A, Wolfert MA, Popik VV; Bioconjugate Chem. (2010), 21: 2076.

6. The enabled state of DNA nanotechnology. Linko V, Dietz H; Current Opinion in Biotechnology (2013), 24:1–7.
The enabled state of DNA nanotechnology

 

Tetrazin TCO Click-Reaktion

Tetrazin-Ligation

 

Die Tetrazin-Ligation beschreibt eine weitere Methode der bioorthogonalen Reaktion. Vergleichbar mit der kupferfreien Click-Chemie kann auch hier auf den Einsatz eines Katalysators verzichtet werden, wodurch in vitro und in vivo Untersuchungen möglich sind. Mit einer ungewöhnlich hohen Reaktionsrate werden mittels Cycloadditionsreaktion s-Tetrazin und ein trans-Cycloocten-Derivat in ein zyklisches Alken umgesetzt1. Das Tetrazin spielt hierbei die reaktive, elektronenreiche Gruppe, die offenkettig oder cyclisch vorliegen kann und mit der substituierenden Gruppe des Cyclooctens unter Abspaltung von Distickstoff N2 zu einem Alken verknüpft wird.

Tetrazin-TCO-Click Reaktion

Im Vergleich zur kupferfreien Click-Chemie der SPAAC (Strain-Promoted Azide-Alkyne Cycloaddition) zeigt diese Click-Variante eine höhere Reaktionsgeschwindigkeit und liefert auch in organischen Lösungsmitteln, Wasser, Zellmedium oder Zelllysat eine gute Ausbeute2,3. Aufgrund seiner nicht toxischen Eigenschaften schränkt diese Reaktion die Funktionalität zellulärer Enzyme nicht ein und ermöglicht somit in vivo Labelling zellulärer DNA oder Proteine, sowie ein Multiplex Labelling2. Auf diese Weise können z.B. Lipide oder andere zelluläre Bestandteile mit einem speziellen Farbstoff markiert werden, der aufgrund verbesserter Photostabilität verlängerte Lebend-Zell-Aufnahmen (3D-Konfokal oder STED-Mikroskopie) ermöglicht und somit besonders hochauflösende mikroskopische Aufnahmen erlaubt4.


Für die kupferfreie Tetrazin TCO Click-Reaktion bietet biomers.net Oligonucleotide mit TCO als 5'- oder
3´-Modifikation an:



Literatur:
1. The inverse electron demand Diels-Alder click reaction in radiochemistry. Reiner T, Zeglis BM; (2014), J Labelled Comp Radiopharm., 57 (4): 285-290.

2. The Tetrazine Ligation: Fast Bioconjugation based on Inverse-electron-demand Diels-Alder Reactivity. Blackman ML, Royzen M, Fox JM; (2008), J Am Chem Soc.; 130 (41): 13518-13519.

3. Rapid oligonucleotide-templated fluorogenic tetrazine ligations. Seckute J, Yang J, Devaraj NK; (2013), Nucleic Acids Research, Vol. 41, No. 15.

4. Super-resolution imaging of the Golgi in live cells with a bioorthogonal ceramide probe. Erdmann RS, Takakura H, Thompson AD, Rivera-Molina F, Allgeyer ES, Bewersdorf J, Toomre D, Schepartz A, (2014), Angew. Chem. Int. Ed. England, 53 (38): 10242-6.