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Modifikationen im Fokus
 

HaloTag® Ligand

HaloTag® Ligand-markierte Oligonucleotide zur funktionellen Proteinanalyse

 

Ein bemerkenswerter Vertreter unter den Protein Tags ist der HaloTag®, der vielseitig Anwendung in der Proteinanalyse findet.

Anwendungen: 
- Proteinaufreinigungen rekombinanter Proteine aus Bakterienzellen oder Zellkulturlysat 
- „Trafficking“ gesuchter Proteine
- Proteinlokalisierung in lebenden und fixierten Zellen
- Multiplex Imaging mittels Antikörper oder GFP
- Analyse der Protein-Protein-Interaktionen

Mit biomers.net können Sie nun auch Oligonucleotide mit einem HaloTag® Liganden markieren

Hierbei wird das Oligonucleotid am 5´oder 3´-Ende mit einem Chloralkanlinker versehen. 
Der eigentliche HaloTag® (siehe Abbildung 1 in grün) ist eine ca. 34 kDa große Haloalkan-Dehalogenase, die als Hydrolase agiert und ein modifiziertes aktives Zentrum aufweist.

Über ein geeignetes Expressionssystem (HaloTag® Vektor von Promega) wird das modifizierte HaloTag® Protein an das „protein of interest“ (siehe Abb.1 in rot) fusioniert, sodass das erhaltene Fusionsprotein nun mittels unterschiedlicher Liganden weiter analysiert werden kann.

Bei der Anbindung des Liganden an das HaloTag® Enzym wird die Halogengruppe des Linkers durch einen nukleophilen Verdrängungsmechanismus abgespalten und freigesetzt, sodass eine kovalente und irreversible Esterbindung zwischen dem Haloalkan und dem Aminosäurerest Aspartat im Enzym ausgebildet werden kann. In der WT-Hydrolase würde das Alkyl-Enzym-Intermediat daraufhin durch einen Histidinrest hydrolysiert. 
Durch einen Aminosäureaustausch im aktiven Zentrum der Haloalkan Dehalogenase (Histidin zu Phenylalanin) wird die katalytische Wirkung jedoch inhibiert und eine stabile und kovalente Verknüpfung zwischen Ligand und HaloTag® Enzym gewährleistet. 

Das HaloTag® Protein bindet hochspezifisch an Chloralkan, das über einen Linker beispielsweise mit einem Oligo verbunden wird (s. Abb.1 in blau). Das Oligo selbst kann bei Bedarf weiter modifiziert werden, z.B. mit einem Fluoreszenzfarbstoff für eine einfache Nachverfolgung. Durch Austausch des Oligonucleotid-Liganden kann die Funktion sowie die Eigenschaften des Fusionsproteins beeinflusst werden (z.B. Membrangängigkeit, Fluoreszenzmarkierung, Oberflächenbindung, etc.).

                Oligonucleotid-Ligand bindet über einen Chloralkanlinker kovalent an ein HaloTag-Fusionsprotein.

Abbildung 1: Oligonucleotid-Ligand mit einem Chloralkanlinker, der das HaloTag®-Fusionsprotein kovalent bindet. 

 

Abbildung 2: Reaktionsmechanismus der Haloalkan Dehalogenase zur kovalenten Verbindung des HaloTag®-Fusionsproteins mit einem Oligoliganden. 


Wir bieten Ihnen 5´- oder 3´- markierte Oligonucleotide mit einem Chloralkanlinker an. Hierbei können Sie zwischen zwei verschiedenen Linkerlängen (O2 oder O4) wählen.
Auf Wunsch sind verschiedene funktionelle Modifikationen am Oligo möglich (Fluoreszenzfarbstoffe, Thiol, Biotin etc.).

HaloTag Chloralkanlinker (O2, O4)

Kontaktieren Sie uns hierzu einfach! 



Literatur:

1. HaloTag: a novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. Los GV, Encell LP, McDougall MG, Hartzell DD, Karassina N, Zimprich C, Wood MG, Learish R, Ohana RF, Urh M, Simpson D, Mendez J, Zimmerman K, Otto P, Vidugiris G, Zhu J, Darzins A, Klaubert DH, Bulleit RF, Wood KV; ACS Chem Biol. (2008), 3(6):373-82. doi: 10.1021/cb800025k.

2. HaloTag Technology: A Versatile Platform for Biomedical Applications. England CG, Luo H, Cai W; Bioconjugate Chem. (2015), 26, 975−986975 DOI: 10.1021/acs.bioconjchem.5b00191.

3. Histidine 289 is Essential for Hydrolysis of the Alkyl-enzyme Intermediate of Haloalkane Dehalogenase. Pries F, Kingma J, Krooshof GH, Jeronimus-Stratingh CM, Bruins AP, Janssen DB; The Journal of Biological Chemistry (1995), DOI: 10.1074/jbc.270.18.10405.



HaloTag® ist ein eingetragenes Warenzeichen der Promega Corporation. Das HaloTag® Verfahren ist von der Promega Corporation lizenziert.

Methacrylamid

Immobilisierung an Oberflächen über Methacrylamid-modifizierte Oligonucleotide

 

Methacrylamid-modifizierte oder auch bekannt als Acrydite-modifizierte Oligonucleotide sind seit einigen Jahren ein fester Bestandteil in der molekularbiologischen Forschung. Über die Polymerisierung freier Acrylsäure-Monomere (Bildung Polyacrylamiden) oder die Kopplung mit Thiol können Methacrylamid-modifizierte Oligonucleotide kovalent an Oberflächen gebunden werden. Über diese schnelle und einfache Anheftung an Oberflächen können gewünschte DNA-Einzelstränge immobilisiert, angereichert, identifiziert oder auch aufgereinigt werden.

Ein bekanntes Beispiel hierfür sind Biochips (Microarrays), bei denen die Methacrylamid-modifizierten Oligonucleotide auf eine Thiol-markierte Glasoberfläche gebunden werden und somit für einzelsträngige DNA zugänglich sind. 
Auf diese Weise ergibt sich eine Vielzahl von möglichen Anwendungen: 

- Überwachung der mRNA Expression
- Sequenzierung von DNA
- Genotypisierung
- Identifizierung von SNP
- Detektion von Viren, Bakterien und anderen Pathogenen

biomers.net bietet 5´-und 3´- Methacrylamid-modifizierte DNA-Oligonucleotide an.



Literatur:

1. Immobilization of acrylamide-modified oligonucleotides by co-polymerization. Rehman FN, Audeh M, Abrams ES, Hammond PW, Kenney M, Boles TC; N. Acids Research. 27, (1998), Bd. 2, 649-655.

2. Mutation typing using electrophoresis and gel-immobilized Acrydite probes. Kenney M, Ray S, Boles TC; Biotechniques (1998), (3):516-21. 

Photocrosslinker

Photocrosslinker – Markierung und Crosslinking von Proteinen und Oligonucleotiden

 

Wie der Name bereits vermuten lässt, werden Photocrosslinker durch Licht angeregt, um eine kovalente Verbindung zwischen zwei Molekülen herzustellen. Meist erfolgt die Lichtinduktion bei Wellenlängen nahe des UV-Bereichs  (250-460 nm abhängig vom Linker) und kann zeitlich und räumlich genau gesteuert werden, z.B. nur in bestimmten Gewebe-Teilen oder zu einem definierten Entwicklungszeitpunkt.

Durch die Anbindung des Photocrosslinkers am Ende eines Oligonucleotids kann ein komplementärer DNA-Abschnitt „punktgenau“ angesteuert werden. Nach Photoinduktion entsteht eine kovalente Bindung zum gegenüberliegenden Strang. So kann beispielsweise eine Promotorregion und die damit verbundene Genexpression analysiert oder auch die endogenen Reparatur-Mechanismen erforscht werden, die Zellen entwickelt haben, um ihre DNA vor UV-Schäden zu schützen. 
Als Alternative zu konventionellen Kopplungsstrategien bieten photoreaktive Linker ebenfalls die Möglichkeit funktionelle Gruppen an Oligonucleotide zu binden. 

Weitverbreitet sind Photocrosslinker auch, um Proteine und DNA kovalent zu verknüpfen
DNA-Protein-Kontakte sind wichtige Schaltstellen in Zellen, sodass eine genaue Kenntnis über die exakten Kontaktbereiche möglicherweise eine Modulation solcher Prozesse erlaubt.

Für ein effektives Crosslinking bieten wir Ihnen verschiedene photoreaktive Gruppen an, die am 
5´-Ende des Oligonucleotids angebunden werden können.

Photocrosslinker: Diazirin, Azidobenzoat, Psoralen



Literatur:

1. Genetically encoded protein photocrosslinker with a transferable mass spectrometry-identifiable label. Yang Y, Song H, He D, Zhang S, Dai S, Lin S, Meng R, Wang C, Chen PR; Nat Commun. (2016), 7:12299. doi: 10.1038/ncomms12299.

2. Photolyase-like Repair of Psoralen-Crosslinked Nucleic Acids. Stafforst T, Hilvert D; Angew. Chem. Int. Ed. (2011), 50, 9483 –9486.

3. Sequence-specific photo-induced cross-linking of the two strands of double-helical DNA by a psoralen covalently linked to a triple helix-forming oligonucleotide. Takasugi M, Guendouz A, Chassignol M, Decout JL, Lhomme J, Thuong NT, Hélène C; Proc Natl Acad Sci U S A. (1991), 88(13):5602-6.

4. UV crosslinking of proteins to nucleic acids. Chodosh LA; Curr Protoc Mol Biol. (2001), Chapter 12:Unit 12.5. doi: 10.1002/0471142727.

Cyanobenzothiazol

Proteinlabelling mittels Cyanobenzothiazol-modifizierter Oligonucleotide

 

Mithilfe Cyanobenzothiazol-markierter Oligonucleotide können geeignete Proteine schnell und effizient markiert und für die Detektion in der Zelle vorbereitet werden, ohne dabei deren Funktion einzuschränken oder zu inhibieren. Hierbei ist die Reaktivität und Spezifität des Cyanobenzothiazol-Oligo-Tags vor allem von der Sequenz des Proteins abhängig. Um ein stabiles Addukt und eine schnelle und selektive Reaktion des Cyanobenzothiazol-tragenden Oligos mit einem Protein zu gewährleisten, ist ein N-terminales Cystein am Protein zwingend notwendig. 
 



Abbildung 1: Reaktionsschemata eines Cyanobenzothiazol-tragenden Oligonucleotids mit einem geeigneten Protein, das ein N-terminales Cystein trägt. 

Die gängige Kopplung von Proteinen und Oligos über Click-Chemie kann aufgrund toxischer Kupferionen intrazellulär nicht angewendet werden. Cyanobenzothiazol ermöglicht hingegen die Kopplung eines Proteins mit einem Oligonucleotid auch in vivo. 
Auf diese Weise wird eine spezifische Markierung des Proteins zur Detektion oder Analyse der Proteinstruktur und Funktion gewährleistet. 

Mögliche Anwendungen:
- Markierung und Lokalisierung spezifischer Proteine
- Lumineszenzanalysen in vivo 
- Nachweis und Quantifizierung intrazellulärer, biochemischer Prozesse in Echtzeit 

Für die effiziente Proteinmarkierung bieten wir Ihnen 5´-Cyanobenzothiazol-markierte Oligonucleotide an. 



Literatur:

1. A Biocompatible In Vivo Ligation Reaction and its Application for Non-Invasive Bioluminescent Imaging of Protease Activity in Living Mice. Godinat A, Park HM, Miller SC, Cheng K, Hanahan D, Sanman LE, Bogyo M, Yu A, Nikitin GF, Stahl A, Dubikovskaya EA; ACS Chem Biol. (2013), 8(5): doi:10.1021/cb3007314.

2. Sequence-Specific 2-Cyanobenzothiazole Ligation. Ramil CP, An P, Yu Z, Lin Q; J Am Chem Soc. (2016), 138(17):5499-502. doi: 10.1021/jacs.6b00982.

Gemcitabin 

Oligonucleotide mit dem Zytostatikum Gemcitabin - dFdC

 

Gemcitabin (2´,2´-Di-Fluoro-Desoxycytidin, dFdC) ist ein Analogon des Pyrimidin-Nucleosids Desoxycytidin (dC). Gemcitabin unterscheidet sich von diesem durch zwei Fluor-Atome (anstelle zweier Wasserstoffatome) an der 2´-Position des Zuckers.



Diese zwei zusätzlichen Fluor-Atome führen zu einer Blockierung der DNA-Replikation.1,2 Interessant ist hierbei besonders, dass nach dem Einbau von Gemcitabin die DNA noch um ein weiteres Nucleotid verlängert wird. Danach bricht die Synthese ab und wird blockiert, was den Tod der Zelle zur Folge hat. Dieser Ablauf wird als „masked chain termination“ bezeichnet, da das letzte Nucleotid nach einem dFdC dieses vor Detektion und Abbau durch Exonucleasen oder DNA-Reparaturenzyme maskiert.3
Aufgrund seiner Wirkung als Zytostatikum wird Gemcitabin in der Chemotherapie als Anti-Tumor-Präparat eingesetzt.3

biomers.net bietet jetzt dFdC für den Einbau in Oligonucloetiden an!
Die interne Kopplung ist an jeder beliebigen Position innerhalb eines Oligonucleotids möglich, auch mehrfache Kopplungen sind herstellbar. Kombinationen mit anderen Modifikationen auf Anfrage.
 



Literatur:

1. 2',2'-Difluoro-deoxycytidine (gemcitabine) incorporation into RNA and DNA of tumour cell lines. Ruiz van Haperen VW, Veerman G, Vermorken JB, Peters GJ; Biochem Pharmacol. (1993); 46(4):762-6.

2. Quantification of gemcitabine incorporation into human DNA by LC/MS/MS as a surrogate measure for target engagement. Wickremsinhe ER, Lutzke BS, Jones BR, Schultz GA, Freeman AB, Pratt SE, Bones AM, Ackermann BL; Anal Chem. (2010); 82(15):6576-83. doi: 10.1021/ac100984h.

3. DNA Repair in Cancer Therapy: Molecular Targets and Clinical Applications. Kelley MR; Academic Press (2012), 95-98.

4. Synthesis and restriction enzyme analysis of oligodeoxyribonucleotides containing the anti-cancer drug 2',2'-difluoro-2'-deoxycytidine. Richardson FC, Richardson KK, Kroin JS, Hertel LW; Nucleic Acids Res. (1992); 20(7): 1763–1768.

Coenzym A

Oligonucleotid-Coenzym A-Konjugate

 

Jetzt neu bei biomers.net: Coenzym A-modifizierte DNA  

Viele Forschungsgebiete erfordern eine gezielte Verknüpfung von möglichst nativen Proteinen mit anderen Bausteinen, die beispielsweise deren Transportverhalten beeinflussen oder eine spezifische Immobilisierung ermöglichen. Durch die Verwendung kleiner 'Tags', die idealerweise an die zu untersuchenden Proteine fusioniert werden können, ohne jedoch dabei deren Faltung oder Funktion zu beeinträchtigen, können Proteine nahezu beliebig kombiniert werden. Ein hochflexibles System macht sich die selektive Verknüpfung des sogenannten ybbR-Tags mit Coenzym A zunutze.

Wir freuen uns, Ihnen nun Coenzym A an Oligos gekoppelt anbieten zu können. Damit ergeben sich vielfältige Möglichkeiten von DNA-Protein-Chimären. 

Ein eindrucksvolles Beispiel finden Sie unter: 
Protein–DNA Chimeras for Nano Assembly

Fragen Sie... gern diskutieren wir Ihr individuelles Projekt!

Coenzym A als 3´- oder 5´-Modifikation
 


Literatur:

- Protein-DNA Chimeras for Nano Assembly. Pippig DA, Baumann F, Strackharn M, Aschenbrenner D, Gaub HE; ACS Nano (2014), 8 (7), pp 6551–6555.

- The Ribosome Modulates Nascent Protein Folding. Kaiser CM, Goldman DH, Chodera JD, Tinoco Jr. I, Bustamante C; Science (2011), 334(6063): 1723–1727. doi:10.1126/science.1209740.