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Erhöhung der Duplex Stabilität
 

Viele molekularbiologische Methoden beruhen auf der Hybridisierung zwischen komplementären DNA-Strängen. Diese Hybridisierung basiert wesentlich auf der Watson-Crick-Paarung der jeweiligen Nucleobasen, die auch die Spezifität der Bindung bestimmt. Neben den hierbei ausgebildeten Wasserstoff-Brücken-Bindungen tragen aber auch Stacking-Effekte zwischen den benachbarten Basenpaaren (hydrophobe und elektrostatische Wechselwirkungen) zur Affinität und Stabilität der gebildeten Doppelhelix bei. 

Die Duplex-Stabilität hängt wesentlich von der Länge und dem GC-Gehalt der Sequenz ab. Insbesondere bei kurzen Oligonucleotiden ist die Duplex-Stabilität oft gering und die damit verbundene Schmelztemperatur Tm niedrig, sodass Affinität und Bindungsstärke nicht mehr ausreichen, um stringente Bedingungen zu erreichen und spezifische Bindungen zu gewährleisten. Durch die Einführung von modifizierten Basen kann die Duplex-Stabilität erhöht und damit eine verbesserte Hybridisierung erzielt werden. 

Modifikation Abkürzung ΔTm Ersetzt
Minor Groove Binder MGB +10° bis +20° C  
C-5 Propynyl-Desoxycytidin pdC +2,8° C dC
C-5 Propynyl-Desoxyuridin pdU +1,7° C dT
Aminoethyl-Phenoxazin-Desoxycytidin AP-dC (G-clamp) +7° bis +21° C dC
5-Methyl-Desoxycytidin 5-Me-dC +1,3° C dC
2-Amino-Desoxyadenosin 2-Amino-dA +3° C dA
Trimethoxystilben Trimethoxystilben +10° C  


Die angegebene Erhöhung der Schmelztemperatur ΔTm ist jeweils als Richtwert zu verstehen, da sie auch von der Sequenzumgebung mit beeinflusst wird und daher variieren kann.

Die modifizierten Basen sind eine attraktive Alternative zu den Patent-geschützen LNATM (Locked Nucleic Acids) Technologien, die i.d.R. eine zusätzliche Lizenzvereinbarung erfordern.

Minor Groove Binder

Minor Groove Binder (MGB)

 

MGB-modifizierte Oligonucleotide besitzen eine erhöhte Schmelztemperatur (Tm) und Spezifität und können äußerst stabile Duplexe mit komplementären DNA-Sequenzen bilden. Hierbei wird die Schmelztemperatur Tm der modifizierten Oligos stark von der Basenzusammensetzung beeinflusst.
Bei der Bindung der Sonde an die Zielsequenz binden Minor Groove Binder (MGB) an die kleine Furche der DNA. Die sichelförmige Gestalt der MGB CDPI3 (Dihydropyrroloindolecarboxylate Tripeptide CDPI3) erlaubt eine exakte räumliche Anpassung an die gekrümmte Struktur der kleinen Furche und ermöglicht damit eine Einlagerung zwischen die Zucker-Phosphat-Ketten des DNA-Rückgrats. Diese isohelikale Konformation wird dabei vor allem mittels wirkender Van-der-Waals Kräfte und hydrophober Wechselwirkungen stabilisiert.
Auf diese Weise kann eine hohe Stabilität des doppelsträngigen Moleküls erzielt werden, sodass auch sehr kurze DNA-Sonden äußerst effizient an die Target-DNA hybridisieren können. 



Abbildung 1 zeigt die Schmelzkurvenanalyse eines MGB CDPI3-modifizierten und eines unmodifizierten Oligos. Der Analyse wurde in Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7.4 durchgeführt. Die Natrium-Konzentration betrug 30 mM; die eingesetzte Konzentration der DNA-Einzelstränge lag bei ca. 1,3 µM. Der Wendepunkt der Schmelzkurve gibt jeweils die Schmelztemperatur Tm des Oligos an. 
Die blaue Kurve stellt ein unmodifiziertes EUB338-Oligo dar: 5´-gctgcctcccgtaggagt-3´. Der Schmelzpunkt liegt hier bei ca. 55°C. 
Die grüne Kurve zeigt die Schmelzkurve eines MGB CDPI3-modifizierten Oligos. Das EUB-Oligo wurde am 3´-Ende mit einer MGB CDPI3-Modifikation markiert: 5´-gctgcctcccgtaggagt-MGB CDPI3. Der hier ermittelte Schmelzpunkt liegt bei ca. 65°C. 
Im direkten Vergleich der beiden Oligonucleotide kann unter den hier gewählten Bedingungen ein Anstieg der Schmelztemperatur um ca. 10°C festgestellt werden. 



Literatur:

1. 3′-Minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Kutyavin IV, Afonina IA, Mills A, Gorn VV, Lukhtanov EA, Belousov ES, Singer MJ, Walburger DK, Lokhov SG, Gall AA, Dempcy R, Reed MW, Meyer RB, Hedgpeth J; Nucleic Acids Research (2000), Volume 28, Issue 2, Pages 655–661.

2. Minor Groove Binder-Conjugated DNA Probes for Quantitative DNA Detection by Hybridization-Triggered Fluorescence. Afonina IA, ReedMW, Lusby E, Shishkina IG, Belousov YS; BioTechniques (2002) 32:940-949 .

C-5 Propynyl-Pyrimidin 

C-5 Propynyl-Desoxycytidin und C-5 Propynyl-Desoxyuridin

 

C5-Propynyl-Derivate der Pyridinbasen stabilisieren die Doppelhelix durch Stacking-Interaktionen und hydrophobe Wechselwirkungen. Die Substitution von dC durch C5-Propynyl-dC erhöht den Tm um ca. 2,8° C pro Modifikation, die Substitution von dU durch C5-Propynyl-dU um ca. 1,7° C. 

      C5-Propynyl Pyrimidine


Literatur:

1. Propynyl groups in duplex DNA: stability of base pairs incorporating 7-substituted 8-aza-7-deazapurines or 5-substituted pyrimidines. He J, Seela F; Nucleic Acids Res. (2002), 5485-5496.

2. Oligodeoxynucleotides containing C-5 propyne anlogs of 2‘-deoxyuridine and 2‘-deoxycytidine. Froehler BC, Wadwani S, Terhorst TJ, Gerrard SR; Tetrahedron Lett. (1992), 33, 5307-5310.

3. Design of modified oligodeoxyribonucleotide probes to detect telomere repeat sequences in FISH assays. Hacia JG, Novotny EA, Mayer RA, Woski SA, Ashlock MA, Collins FS, Nucleic Acids Res. (1999), 27, 4034-4039. 

4. Evaluation of C-5 propynyl pyrimidine-containing oligonucleotides in vitro and in vivo. Shen et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. (2003), 13, 129-142.



Die C5-Propynyl-Pyrimidin-Bausteine für die Oligosynthese sind patentrechtlich geschützt. Die Firma Glen Research (www.glenresearch.com) bietet entsprechende Phosphoramidite an und biomers.net kann gemäß nachstehender Lizenzvereinbarung modifizierte Oligos mit C5-Propynyl-Pyrimidinen für Forschungszwecke herstellen.*

* This product is covered by patents or patents pending owned by Isis Pharmaceuticals, Inc. (“Isis”). Purchase of this product includes a limited license to use this product solely for internal research. This license specifically excludes (and you have no right to use this product for): (a) therapeutic or diagnostic applications (including products or services that incorporate this product), (b) any in vivo toxicity/safety study in support of an investigational new drug application (or foreign counterpart), (c) resale (including sale of any products or services that incorporate this product) or (d) gene functionalization activities (including products or services that incorporate data derived from gene functionalization activities) if such activities have commercial applications, any and all of which require a separate license from Isis. Neither this product nor any product created through its use may be used in human clinical trials. In the event you have a separate agreement with Isis regarding this product which explicitly states that the foregoing is not applicable to you, your use of this product will be governed by the terms of such agreement. In no event does the limited license with the purchase of this product expand or alter the scope of the license granted pursuant to such agreement.

AP-dC

2-Aminoethyl-Phenoxazin-Desoxycytidin (AP-dC, G-Clamp)

 

2-Aminoethyl-Phenoxazin-Desoxycytidin (AP-dC) ist ein Analogon des Cytidins. Es kann mit Guanosin spezifisch paaren, über die erweiterte Ringstruktur aber vier Wasserstoff-Brücken mit diesem ausbilden. Hierdurch wird die Schmelztemperatur um etwa 7° bis 21° C pro Modifikation erhöht. Die tatsächliche Änderung des Tm wird von den benachbarten Basen stark beeinflußt und ist daher sequenzabhängig.

2-Aminoethyl-phenoxazin-desoxycytidin (AP-dC)


Literatur:

1. A cytosine analogue capable of clamp-like binding to a guanine in helical nucleic acids. Lin KY, Matteucci MD; J. Am. Chem. Soc. (1998), 120, 8531-8532.

2. A cytosine analog that confers enhanced potency to antisense oligonucleotides. Flanagan WM, Wolf JJ, Olson P, Grant D, Lin K, Wagner RW, Matteucci MD; Proc. Natl. Acad. Sci. (1999), 96, 3513-3518.

3. Binding affinities of oligonucleotides and PNAs containing phenoxazine and G-clamp cytosine analogues are unusually sequence-dependent. Ortega JA, Blas JR, Orozco M, Grandas A, Pedroso E, Robles J; Org. Lett. (2007), 9, 4503-4506.



Das AP-dC (G-Clamp) ist patentrechtlich geschützt. Die Firma Glen Research (www.glenresearch.com) bietet ein entsprechendes Phosphoramidit an und biomers.net kann gemäß nachstehender Lizenzvereinbarung modifizierte Oligos mit AP-dC für Forschungszwecke herstellen.*

* This product is covered by patents or patents pending owned by Isis Pharmaceuticals, Inc. (“Isis”). Purchase of this product includes a limited license to use this product solely for internal research. This license specifically excludes (and you have no right to use this product for): (a) therapeutic or diagnostic applications (including products or services that incorporate this product), (b) any in vivo toxicity/safety study in support of an investigational new drug application (or foreign counterpart), (c) resale (including sale of any products or services that incorporate this product) or (d) gene functionalization activities (including products or services that incorporate data derived from gene functionalization activities) if such activities have commercial applications, any and all of which require a separate license from Isis. Neither this product nor any product created through its use may be used in human clinical trials. In the event you have a separate agreement with Isis regarding this product which explicitly states that the foregoing is not applicable to you, your use of this product will be governed by the terms of such agreement. In no event does the limited license with the purchase of this product expand or alter the scope of the license granted pursuant to such agreement.

5-Methyl-dC 

5-Methyl-Desoxycytidin

 

5-Me-Pyridine erhöhen die Duplex-Stabilität durch verbesserte Stacking-Interaktionen. Auch in Triplex-Helices wird durch die 5-Me-dC Substitution die Schmelztemperatur deutlich erhöht. Pro Modifikation erhöht sich der Tm um etwa 1,3° C. Bei mehreren Modifikationen im Oligo ist die Tm-Änderung auch für eine größere Anzahl von Substitutionen additiv. 

5-Methyl-desoxycytidin (5-Me-dC)


Literatur:

1. Origins of the large differences in stability of DNA and RNA helixes: C-5 methyl and 2‘-hydroxyl effects. Wang S, Kool ET; Biochemistry (1995), 34, 4125-4132.

2. Poly(pyrimidine)*poly(purine) synthetic DNAs containing 5-methylcytosine form stable triplexes at neutral pH. Lee SL, Woodsworth ML, Latimer LJP, Morgan AR; Nucleic Acids Res. (1984), 16, 8603-8614.

2-Amino-Desoxyadenosin

2-Amino-Desoxyadenosin (2,6-Diaminopurin)

 

Das Adenosin-Analogon 2-Amino-Desoxyadenosin paart spezifisch mit Thymidin. Die zusätzliche Aminogruppe an der Position 2 des Adenosins ermöglicht die Ausbildung einer weiteren Wasserstoff-Brücken-Bindung. Hierdurch wird die Schmelztemperatur um etwa 3° C pro Modifikation erhöht.

2-Amino-desoxyadenosin (2,6-Diaminopurin)


Literatur:

1. Thermodynamic studies of base pairing involving 2,6-diaminopurine. Cheong C, Tinoco I, Chollet A; Nucleic Acids Res. (1988), 16, 5115-5122.

2. DNA containing the base analogue 2-aminoadenine: preparation, use as hybridization probes and cleavage by restriction endonucleases. Collet A, Kawashima E; Nucleic Acids Res. (1988), 16, 305-317.

3. Oligonucleotides containing 2-aminoadenine and 5-methylcytosine are more effective as primers for PCR amplification than their non-modified counterparts. Lebedev Y, Akopyants N, Azhikina T, Shevchenko Y, Potapov V, Stecenko D, Berg D, Sverdlov E; Genetic Anal. (1996), 13, 15-21.

Trimethoxystilben-Kappe

Trimethoxystilben

 

Die 5‘-Trimethoxystilben-Kappe kann sich planar über dem terminalen Basenpaar anlagern. Hierdurch wird die Schmelztemperatur für kurze Duplexe um etwa 10° C erhöht. Da die Anlagerung nur bei korrekter Watson-Crick-Paarung des vorherigen Basenpaares möglich ist, wird gleichzeitig eine verbesserte Diskriminierung von Fehlpaarungen am 5‘-Ende des Oligos erreicht.

5´-Trimethoxystilben

5´-Trimethoxystilbe-Kappe



Literatur:

1. 5’-Tethered stilbene derivatives as fidelity- and affinity-enhancing modulators of DNA duplex stability. Dogan Z, Paulini R, Rojas Stütz JA, Narayanan S, Richert C; J. Am. Chem. Soc. (2004), 126, 4762-4763.

2. Clamping down on weak terminal base pairs: oligonucleotides with molecular caps as fidelity-enhancing elements at the 5’- and 3’-terminal residues. Narayanan S, Gall J, Richert C; Nucleic Acids Res. (2004), 32, 2901-2911.